LOC66273变异剪接体2对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化和增殖凋亡的影响

发布时间：2018-03-19 22:14

本文选题：LI-2基因　切入点：LI-2蛋白　出处：《复旦大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分L1-2基因生物信息学分析及细胞定位 [目的]初步了解LI-2基因及蛋白的结构、功能和亚细胞定位,研究LI-2基因及蛋白在小鼠各组织分布情况,为后续研究提供基础。 [方法]运用生物信息学方法分析LI-2基因及蛋白的结构和功能,在荧光显微镜下观察其亚细胞定位。采用半定量RT-PCR检测小鼠各组织LI-2基因mRNA水平,Western-blot免疫印迹法检测小鼠各组织LI-2蛋白表达水平。CREB荧光素酶反式报告检测系统的高通量筛选技术筛查与CREB相互作用的调控基因。 [结果](1)小鼠LI-2基因位于染色体7E2上,可译框架为789bp,编码122个氨基酸,预测分子量为13.2kDa,等电点为7.77；系统发育分析表明,LI-2基因在多种物种体内高度保守,但与任何已知基因和蛋白质没有明显同源性。保守域分析表明,LI-2中有一个预测的Mth938结构域(氨基酸残基5-120)；(2)LI-2基因在脂肪、骨骼肌、小肠、肺及肾脏组织均有表达,但在脂肪和骨骼肌组织表达较高；LI-2的亚细胞定位提示,GFP-LI2融合蛋白在细胞质中弥漫分布,并在核周围有一些高度集中点；(3)CREB荧光素酶报告基因检测系统结果提示过表达LI-2增加了CREB的活性,其活性是空白对照组的2.5倍。 I结论]LI-2基因在多种物种体内高度保守,提示了它具有重要的功能。LI-2在白色脂肪组织高表达,同时基于定量的CREB荧光素酶反式报告检测系统的高通量功能性筛选平台显示了与CREB转录活性相关的基因中包括LI-2基因。这些信息都提示了LI-2基因可能与成脂分化有关。第二部分LI-2在MDI诱导3T3-L1细胞成脂分化过程中的表达变化 [目的]研究MDI三联诱导3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中LI-2变化情况。 [方法]本部分实验通过油红染色、Western-Bloting印迹、半定量RT-PCR等实验技术观察研究MDI三联诱导3T3-L1前脂肪细胞成脂0、2、4、8天细胞形态、脂滴沉积和LI-2基因mRNA及蛋白水平变化情况。 [结果](1)MDI诱导3T3-L1前脂肪细胞2d后,细胞逐渐变圆变亮,梭形前脂肪细胞逐渐变为椭圆形,胞浆内可见油红0染成亮红色的少量脂滴,诱导分化6d,胞核四周出现较大脂滴；诱导分化后8d,可见90%以上细胞具有成熟脂肪细胞表型。(2)半定量RT-PCR结果显示MDI三联诱导4d后,3T3-L1前脂肪细胞的LI-2mRNA水平显著升高(P0.05),并在分化过程中持续增长；Western blot结果显示3T3-L1前脂肪细胞内的IL-2蛋白水平随着分化逐渐增多,诱导第4天变化明显,有显著差异(P0.05)。 [结论]用经典的鸡尾酒MDI三联诱导可以成功的建立3T3-L1前脂肪细胞成脂分化模型,为后续实验奠定基础。随着3T3-L1前脂肪细胞分化,我们发现LI-2基因的mRNA和蛋白水平均较分化早期明显升高,这进一步证实了LI-2与细胞成脂分化相关。第三部分过表达LI-2对3T3-L1细胞增殖和分化的影响 [目的]在细胞过表达LI-2的情况下,研究LI-2对3T3-L1细胞成脂分化及细胞增殖和凋亡的影响。 [方法](1)用pcDNA3.1-LI2质粒转染3T3-L1前脂肪细胞,用倒置显微镜分别观察转染质粒pcDNA.3.1-LI2,转染pcDNA.3.1空白载体以及MDI诱导的未转染任何质粒的三组3T3-L1前脂肪细胞的细胞形态变化,并用油红染色观察细胞脂滴沉积情况；(2)细胞增殖活力检测(MTT法)检测上述三组细胞连续培养8天增殖情况；(3)用流式细胞仪检测分析LI-2对细胞凋亡的影响；(4)用流式细胞仪对上述三组细胞进行细胞周期检测；(5)采用实时荧光定量PCR和Western blot免疫印迹法检测过表达LI-2对3T3-L1细胞成脂分化相关基因的mRNA及蛋白表达水平的影响。 [结果](1)过表达LI-2的3T3-L1前脂肪细胞在没有MDI三联诱导下,可见细胞逐渐变圆变亮,梭形成纤维细胞逐渐变为椭圆形,与MDI诱导的3T3-L1前脂肪细胞变化类似,均发生了脂肪分化,仅转染pcDNA.3.1空白载体的3T3-L1前脂肪细胞形态未有明显变化。用油红O细胞染色可见,三组细胞培养8天后,pcDNA.3.1-LI2转染3T3-L1前脂肪细胞和MDI诱导的3T3-L1前脂肪细胞在低倍镜和高倍镜下观察均可见大片亮红的脂滴,但pcDNA.3.1空白载体转染的3T3-L1前脂肪细胞培养8天后仅见极少数脂滴；(2)用MTT法检测空白对照组、转染pcDNA.3.1-LI2质粒组和转染pcDNA.3.1空白载体组细胞存活率,结果提示转染pcDNA.3.1-LI2质粒组的细胞存活率相对于其他两组在转染后4、6、8天时间点均明显下降(P0.05)；(3)流式细胞仪在分析细胞周期分布提示转染pcDNA.3.1空白载体的细胞,在用血清处理24小时或36小时后,S时期和G2/M时期的细胞数量大大增长。相反地,在血清处理24小时或36小时后,处于S时期和G2/M时期的L12过表达的3T3-L1细胞的比例几乎没有变化(P0.05)；(4)流式细胞仪测转染2天和4天三组细胞凋亡率,结果提示三组细胞4天细胞凋亡率均较2天增多,但各组间无明显差异；(5)成脂分化的两个关键基因PPARγ和C/EBP α的mRNA水平在pcDNA3.1-LI2转染的3T3-L1前脂肪细胞中高于空白载体对照组,有显著差异(P0.05,),基因水平也随着培养天数逐渐升高；Western blot检测3T3-L1前脂肪细胞在转染pcDNA3.1-LI-2或pcDNA3.1空白载体后4天和8天的PPARγ、C/EBP α、PREF-1、GADD153、α FABP和FAS的蛋白水平,结果提示,细胞转染后4天和8天,过表达LI-2细胞的促成脂基因PPARγ、 C/EBP α和助于脂肪酸转运、合成的α-FABP、FAS蛋白表达水平明显高于空白载体对照组,而其抑制前脂肪细胞分化的Pref-1和GADD153蛋白表达水平明显低于空白载体对照组。 [结论]L1-2在促进促成脂调节因子的表达的同时也会抑制成脂负调节因子的表达,有利于成脂分化的进行。另外L1-2可以抑制前脂肪细胞增殖,有促进前细胞进入成脂分化的作用,但在本部分实验未观察到LI-2对于细胞凋亡的影响,我们将进一步研究沉默LI-2对于细胞凋亡的影响。第四部分沉默LI-2对3T3-L1细胞凋亡和分化的影响 [目的]通过沉默LI-2基因来进一步探索LI-2与3T3-Ll前脂肪细胞凋亡和分化的关系及具体机制,从正反两个方面来阐明这一论题。 [方法](1)用siRNA干扰片段转染3T3-Ll前脂肪细胞,用倒置显微镜分别观察转染siRNA干扰片段转染组及转染阴性对照non-siRNA质粒组的细胞形态变化,并用油红染色观察细胞脂滴沉积情况；(2)用Hoechst33342试剂细胞染色后在荧光显微镜观察细胞凋亡情况,并用流式细胞仪分析检测细胞凋亡；(3)Ac-DEVD-AMC分析各组细胞在不同时间点caspase-3的活性和用Western blot免疫印迹法检测caspase-3蛋白表达水平；(4)CREB双荧光素酶报告检测系统分析沉默LI-2对CREB活性的影响,同时采用Western blot免疫印迹法检测CREB和p-CREB的蛋白表达水平；(5)采用实时荧光定量PCR和Western blot免疫印迹法检测沉默LI-2对3T3-L1细胞成脂分化相关基因的mRNA及蛋白表达水平的影响。 [结果](1)沉默LI-2的两组3T3-L1前脂肪细胞在MDI三联诱导下,细胞形态未有明显变化,而MDI诱导的阴性对照组的3T3-L1前脂肪细胞逐渐变圆变亮,梭形成纤维细胞逐渐变为椭圆形,发生了脂肪分化。用油红O细胞染色可见,三组细胞培养8天后,siLI-2-1、siLI-2-2转染的3T3-L1前脂肪细胞仅见极少数脂滴,MDI诱导的阴性对照组细胞在低倍镜和高倍镜下观察均可见大片亮红的脂滴；(2)3T3-L1前脂肪细胞转染siLI-2-1、siLI-2-2或non-siRNA后2天,开始MDI三联诱导4天后,荧光显微镜可观察到转染siLI-2-1、siLI-2-2细胞胞核皱缩,呈碎片状,边缘化,且有凋亡小体形成,而转染non-siRNA的细胞胞核形态完整；流式细胞仪检测转染2天和4天三组细胞凋亡率,结果提示,沉默LI-2的两组细胞在MDI三联诱导下,凋亡率相对于阴性对照组明显升高；(3)上述三组细胞在MDI三联诱导4天后,根据释放的AMC荧光强度的大小,测定caspase-3的活性结果提示,沉默LI-2的两组细胞在MDI三联诱导下,caspase-3的活性相对于阴性对照组明显升高,同时Western blot免疫印迹法检测结果显示caspase的蛋白表达水平也明显高于阴性对照组；(4)CREB荧光素酶反式报告检测系统的检测结果显示转染后,用MDI三联诱导三组细胞2天和4天发现,沉默LI-2组的相对荧光素酶活性要明显低于阴性对照组(P0.05)；western bloting检测各组细胞的CREB和pCREB蛋白表达水平的结果提示,LI-2基因沉默组的细胞pCREB蛋白表达水平要明显低于阴性对照组(P0.05),但三组细胞的CREB蛋白表达水平无显著差异；(5)沉默LI-2基因抑制3T3-L1前脂肪细胞细胞PPARγ和C/EBP α基因mRNA和蛋白表达水平,同时也抑制了助于脂肪酸转运、合成的α FABP、FAS蛋白表达,但成脂负调控因子Pref-1和GADD153蛋白表达水平明显高于阴性对照组。 [结论] L1-2一方面通过调节某些转录因子的表达促进细胞成脂分化,另一方面通过抑制细胞增殖和凋亡来维持成脂分化的进行。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】