iNOS抑制剂AG和1400W对大鼠肺成纤维细胞CTGF表达和肌成纤维细胞表型转化的影响

发布时间：2018-05-01 15:23

  本文选题：氨基胍 + 转化生长因子　； 参考：《河北医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：目的：肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是一种由多种因素引起的肺间质性病变。肺纤维化时，肺间质中的胶原纤维大多由肌成纤维细胞(Myofibroblast,MFb)合成。肌成纤维细胞是以表达-平滑肌肌动蛋白(smooth musle actin,-SMA)为标志的成纤维细胞。氨基胍(aminoguanidine,AG)是诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxidesynthase,iNOS)抑制剂；1400W是一种选择性较强的高效iNOS抑制剂。AG或1400W对于离体肺成纤维细胞结缔组织生长因子(connective tissuegrowth factor,CTGF)及肌成纤维细胞表型转化的影响目前尚未见报道。RNA干扰（RNA interference,RNAi）作为一种新兴的基因水平调控技术，通过合成特异性小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默靶基因的表达,已成为基因功能研究和基因治疗的全新手段。因此，本实验通过离体观察AG和1400W对大鼠肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达的影响；并利用CTGF siRNA技术阐明AG和1400W对肺成纤维细胞CTGF及肌成纤维细胞表型转化影响的机制，为评价iNOS抑制剂在肺纤维化防治中的作用提供资料。 方法:体外分离培养原代雄性SD大鼠(130-150g)肺成纤维细胞；MTT法测定AG和1400W对肺成纤维细胞存活率的影响；Western Blot法测定肺成纤维细胞CTGF及-SMA的蛋白表达。 结果： 1TGF-诱导肺成纤维细胞CTGF蛋白表达的最佳时间点 基础状态的肺成纤维细胞是指正常培养的肺成纤维细胞。与相应的对照组相比，24h、48h、72h CTGF的表达均上调（P＜0.01），与24h、72h时间点相比，48h时间点上调更明显（P＜0.05）。因此，本实验将48h定为TGF-诱导基础状态的肺成纤维细胞CTGF蛋白表达的最佳时间点。 TGF-处理后的细胞是指经TGF-(10ng/ml)刺激48h的肺成纤维细胞。与相应的对照组相比，TGF-诱导24h、48h、72h时TGF-处理后的肺成纤维细胞CTGF蛋白表达均上调（P＜0.05, P＜0.01）。 2不同浓度的AG和1400W对基础状态及TGF-处理后的肺成纤维细胞存活率的影响 与对照组相比，1mmol/L AG对两种状态的肺成纤维细胞的作用均无无统计学意义（P＞0.05），而当AG浓度达到5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L或50mmol/L时，其存活率显著增高（P＜0.01，P＜0.001）。 与对照组相比，1400W随浓度变化对两种状态的肺成纤维细胞存活率的影响均无统计学意义（P＞0.05）。 3AG和1400W对肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达的影响 3.1不同浓度的AG和1400W对基础状态的肺成纤维细胞CTGF蛋白及-SMA表达的影响 与对照组相比，，0.1mmol/L的AG对基础状态的肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）,1mmol/L的AG明显上调CTGF及-SMA蛋白表达（P＜0.01），而10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L的AG则剂量依赖性下调肺成纤维细胞的CTGF及-SMA蛋白表达（P＜0.05,P＜0.01）。说明低浓度AG（1mmol/L）诱导基础状态的肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达上调，而高浓度AG（10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L）抑制其表达。 与对照组相比，20nmol/L的1400W明显上调肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达（P＜0.05），40nmol/L和80nmol/L均无显著性差异（P＞0.05）,160nmol/L显著下调其表达（P＜0.05）。说明低浓度1400W（20nmol/L）诱导基础状态的肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达上调，而高浓度1400W（160nmol/L）抑制其表达。 3.2不同时间点AG和1400W对基础状态的肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达的影响 与相应的对照组相比，AG（1mmol/L）24h肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达上调无显著性差异（P＞0.05），48h、72h CTGF蛋白表达均上调（P＜0.001，P＜0.05）,48h、72h-SMA蛋白表达均明显上调（P＜0.01,P＜0.05）。与72h时间点相比，48h时间点CTGF及-SMA蛋白表达上调更明显（P＜0.01，P＜0.05）,因此，本实验将48h定为AG（1mmol/L）对肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达的最佳时间点。 与相应的对照组相比，1400W（20nmol/L）24h、48h CTGF及-SMA蛋白表达均上调（P＜0.05，P＜0.01），72h时间点无明显变化（P＞0.05）。与24h时间点相比，48h CTGF及-SMA蛋白表达上调更明显（P＜0.05）。因此，48h CTGF及-SMAF蛋白表达上调最明显。 4不同浓度的AG和1400W对TGF-处理的肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达的影响 与基础状态的肺成纤维细胞组相比，TGF-处理组CTGF及-SMA蛋白表达均上调（P＜0.01）。与TGF-处理组相比，TGF-+AG(1mmol/L)组CTGF及-SMA蛋白表达无显著差异（P＞0.05），TGF-+AG（10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L）则剂量依赖性下调肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达(P＜0.05,P＜0.01）。说明低浓度1mmol/L AG对TGF-处理的肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达无明显影响，高浓度10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L AG抑制其表达。 与基础状态细胞组相比，TGF-处理组CTGF及-SMA蛋白表达明显上调（P＜0.01）。与TGF-组相比，TGF-+1400W(10nmol/L、20nmol/L)组CTGF及-SMA蛋白表达无显著性差异（P＞0.05），TGF-+1400W(40nmol/L、80nmol/L)组抑制CTGF及-SMA蛋白表达（P＜0.05,P＜0.01）。 5抑制效果最佳的CTGF siRNA特异靶序列的筛选 与NC siRNA相比，6737siRNA组CTGF和-SMA的表达均有所下调(P＜0.01,P＜0.05），6738siRNA组CTGF和-SMA的表达下调(P＜0.05），两组对CTGF抑制率分别为（425）%、(294)%。以6737siRNA下调最明显（P＜0.01）。说明6737siRNA对CTGF的抑制效果最佳。 6CTGF-siRNA对AG或1400W诱导的肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达的影响 与NC组相比,6737siRNA下调CTGF及-SMA蛋白表达(P＜0.05）。与AG(1mmol/L)组相比，AG+NC组对CTGF及-SMA蛋白表达无明显影响（P＞0.05）。与AG+NC组相比，AG+6737siRNA组CTGF及-SMA蛋白表达明显下调(P＜0.01）,AG+6738siRNA组CTGF及-SMA蛋白下调（P＜0.05）。说明6737siRNA、6738siRNA对AG诱导的CTGF的表达均有抑制作用，抑制率分别为（416）%、(244)%，并导致-SMA蛋白表达下调。 与1400W+NC组相比，1400W+6737siRNA组和1400W+6738siRNA组CTGF及-SMA蛋白表达均明显下调(P＜0.01,P＜0.05）。 结论： 1低浓度的AG（1mmol/L）和1400W(20nmol/L)可诱导基础状态的肺成纤维细胞CTGF蛋白表达，并促进肌成纤维细胞表型转化；而高浓度AG (10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L)和1400W(160nmol/L)可下调肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达。 2低浓度的AG（1mmol/L）和1400W(20nmol/L)对TGF-诱导的肺成纤维细胞CTGF及-SMA蛋白表达无明显影响；高浓度的AG (10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L)抑制其表达。 3CTGF siRNA可阻断AG(1mmol/L）和1400W(20nmol/L)诱导的肺成纤维细胞CTGF蛋白表达上调，并导致-SMA蛋白表达下调。说明CTGF蛋白表达的下调阻碍了肺肌成纤维细胞表型转化。
[Abstract]:Objective: pulmonary fibrosis (PF) is a pulmonary interstitial lesion caused by a variety of factors. During pulmonary fibrosis, the collagen fibers in the pulmonary interstitium are mostly synthesized by Myofibroblast (MFb). Myofibroblast is a fibroblast characterized by the expression of smooth musle actin (-SMA). Aminoguanidine (aminoguanidine, AG) is an inhibitor of inducible nitric oxide synthase (inducible nitric oxidesynthase, iNOS), and 1400W is a highly selective and highly efficient iNOS inhibitor.AG or 1400W for the transformation of connective tissue growth factor (connective tissuegrowth) and myofibroblast in isolated lung fibroblasts. .RNA interference (RNA interference, RNAi) has not been reported as a new gene level regulation technique, which has become a new means of gene function research and gene therapy by synthesizing specific small interference RNA (small interfering RNA, siRNA) silent target gene. Therefore, this experiment is made by observing AG and 1400W in vitro. The effect of CTGF and -SMA protein expression in rat lung fibroblasts, and the mechanism of the effect of AG and 1400W on the phenotypic transformation of pulmonary fibroblasts CTGF and myofibroblast by CTGF siRNA technique, and to provide information for evaluating the role of iNOS inhibitors in the prevention and treatment of pulmonary fibrosis.
Methods: the primary male SD rat (130-150g) lung fibroblasts were isolated and cultured in vitro, and the effect of AG and 1400W on the survival rate of lung fibroblasts was measured by MTT, and the protein expression of CTGF and -SMA in lung fibroblasts was measured by Western Blot.
Result锛

本文编号：1829956