碱性成纤维细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化影响的研究

发布时间：2018-06-04 09:49

  本文选题：骨髓间充质干细胞 + 碱性成纤维细胞生长因子　； 参考：《广西医科大学》2011年硕士论文

【摘要】：目的：观察体外培养的兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)生长特性及其分化潜能,研究不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化效果的影响。 方法：采用全血贴壁法分离纯化及体外培养兔骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜下每天观察BMSCs的形态及生长状况。第二代BMSCs通过流式细胞仪检测细胞表面抗原检测并诱导其向软骨细胞分化,行HE染色和阿尔新蓝染色鉴定,诱导BMSCs向成骨细胞分化,行茜素红染色和碱性磷酸酶染色鉴定。取第2代BMSCs细胞进行成骨诱导,于成骨诱导液中加入不同浓度的bFGF,根据加入的bFGF终浓度不同分为5个实验组(组1：bFGF浓度1ng/mL,组2：bFGF浓度5ng/mL,组3：bFGF浓度10ng/mL,组4：bFGF浓度50ng/mL1,组5：bFGF浓度100ng/mL)和空白对照组(bFGF浓度0ng/mL)。连续14天倒置显微镜下观察BMSCs的形态及生长状况,行碱性磷酸酶(ALP)活性定量检测及骨钙素(0C)定量检测观察不同组间骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化效能的差异。 结果：体外全血贴壁法分离纯化培养的第三代兔骨髓间充质干细胞经流式细胞仪鉴定高表达细胞表面抗原CD29(92.23%)及CD44(80.01%),低表达CD45(1.91%),纯度较高且生物特征基本一致,并能在特定的诱导下分化成为软骨细胞,HE染色下胞质有黑色颗粒,阿尔新蓝染色可见蓝色的酸性粘多糖存在；诱导BMSCs分化为成骨细胞后,经茜素红染色可见矿化结节,碱性磷酸酶染色为阳性。诱导成骨过程中bFGF能有效促进BMSCs向成骨细胞分化(P0.01),实验组的碱性磷酸酶及骨钙素定量检测表达水平均较空白组明显增高,其中浓度为50ng/mL的bFGF促进BMSCs向成骨细胞分化效果最明显(P0.01)。 结论：全血贴壁分离法能有效在体外分离纯化出BMSCs,而bFGF则能在体外有效的促进BMSCs向成骨细胞分化,并且效果与浓度相关。
[Abstract]:Objective: to observe the growth characteristics and differentiation potential of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) cultured in vitro. To study the effects of basic fibroblast growth factor-bFGFs at different concentrations on the differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) into osteoblasts. Methods: rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured by whole blood adherent method. The morphology and growth of BMSCs were observed under inverted phase contrast microscope. The second generation of BMSCs was detected by flow cytometry and induced to differentiate into chondrocytes. He staining and Albumin blue staining were used to identify the differentiation of BMSCs into osteoblasts. Alizarin red staining and alkaline phosphatase staining were used to identify the differentiation of BMSCs into osteoblasts. The second passage of BMSCs cells were used to induce osteogenesis. Different concentrations of bFGF were added to osteoblast inducer. According to the final concentration of bFGF added, five experimental groups were divided into five groups (1:bFGF concentration of 1 ng / mL, 2:bFGF concentration of 5 ng / mL, 3:bFGF concentration of 10 ng / mL, 4:bFGF concentration of 50 ng / mL, 5:bFGF concentration of 100 ng / mL) and control group. The morphology and growth of BMSCs were observed under inverted microscope for 14 days. The activity of alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin (Osteocalcin) were measured quantitatively. The differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts was observed in different groups. Results: the third generation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells isolated and purified by whole blood adherent method in vitro were identified by flow cytometry. After inducing BMSCs to differentiate into osteoblasts, the mineralized nodules could be observed by alizarin red staining, while black granules could be found in the cytoplasm of chondrocytes under HE staining, and blue acid mucopolysaccharide could be found in Alxin blue staining. Alkaline phosphatase staining was positive. During osteogenesis, bFGF could effectively promote the differentiation of BMSCs into osteoblasts. The expression levels of alkaline phosphatase and osteocalcin in the experimental group were significantly higher than those in the blank group. The effect of bFGF with the concentration of 50ng/mL on the differentiation of BMSCs into osteoblast was the most obvious. Conclusion: the whole blood adherent separation method can effectively purify BMSCs in vitro, while bFGF can effectively promote the differentiation of BMSCs into osteoblasts in vitro, and the effect is related to the concentration of BMSCs.
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

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本文编号：1976922