湖北地区汉坦病毒基因特征研究及假病毒的构建

发布时间：2018-06-09 01:33

  本文选题：汉坦病毒 + 进化　； 参考：《武汉大学》2012年博士论文

【摘要】：目的： 研究近年来流行在湖北地区的汉坦病毒的基因特征,并构建不同型别汉坦病毒假病毒,从而为进一步研究汉坦病毒G蛋白的功能提供新的手段。 方法： 1.湖北江夏地区鼠肺标本、HFRS患者血清的收集及筛选：获取2009-2011年间江夏区的6个采样点(胡家村、姚家湾、段岭庙、敖家边、山坡和张家湾)的鼠肺标本；并收集2009-2011年间江夏区临床诊断为肾综合征出血热(HFRS)的患者血清标本。利用间接免疫荧光(IFA),空斑减数中和实验(FRNT)以及RT-PCR对收集的样本进行筛选。 2.用RT-PCR法对病毒基因进行扩增,PCR产物克隆并测序,用MEGA等生物学软件对病毒的部分S片段进行系统进化分析。了解江夏区汉坦病毒流行的型别、基因特征。 3.采用汉坦病毒感染乳BALB/c小鼠,对阳性标本进行病毒分离、传代,获得病毒株。并进行全基因组测序,用生物学软件分析其基因组特征。 4.利用VSV△G-GFP (Luciferase)骨架分别构建含无名病毒(SNV),安第斯病毒(ANDV),汉滩病毒(HTNV)以及希望山病毒(PHV)的汉坦病毒假病毒,并对其感染性进行研究。 5.用相应的HFRS/HPS抗血清,单克隆抗体等对这些汉坦病毒假病毒的抗原性进行研究。同时用受体特异性的抑制剂与其作用,观察假病毒进入细胞的方式,并与汉坦病毒原型分离株进行比较。 6.构建致病性(SNV)和非致病性(PHV)嵌和G蛋白的汉坦病毒假病毒(即：SNVGn与PHVGc组合形成嵌和G蛋白,PHVGn与SNV Gc组合形成嵌合G蛋白)。并用汉坦病毒肺综合征(HPS)病人的抗血清与之反应检测其抗原性。 7.用抗体与HV004G蛋白构建的汉坦病毒假病毒反应,然后用流式细胞仪检测。另外用阿比朵尔作用Vero-E6细胞后,再加入假病毒,观察其抑制效果。 结果： 1.捕获动物的带毒率及血清阳性率：共捕获173只动物,包括黑线姬鼠48只,褐家鼠125只,从3只褐家鼠和4只黑线姬鼠中检测到了汉坦病毒核酸,鼠肺标本中汉坦病毒核酸总检出率为4.05%。同时收集到11份HFRS病人血清,从其中的10份检测到了HTNV或SEOV中和抗体(有2份检测出汉坦病毒核酸)。 2.所有汉坦病毒阳性标本部分S片段的测序结果：江夏地区鼠间流行汉坦病毒为HTNV和SEOV型,进化分析显示,来自褐家鼠的汉坦病毒基因序列(JX1143、JX0937、JX1018和JX1028)与SEOV (Z37、ZT10株等)形成一簇,属于SEOV型。从黑线姬鼠中扩增出的汉坦病毒序列(HV003、HV004和HV005)和两个从HFRS病人中得到的病毒序列(s200903和s201012),属于HTNV型,组成一个新的分枝。 3.对分离得到的HV004株全基因组测序结果显示：HV004属于HTNV型汉坦病毒,其全基因序列与其它HTNV (76-118, A9, CGHu2, CGRn45, Q32株等)比较,核酸的同源性为83%-90%,推导出氨基酸的同源性为95%-99%。对S,M和L全序列分析均表明HV004株为一个独立的分枝。在分离过程中,经BALB/c乳鼠传3代后,仅在S片段3’非编码区有一处发生了碱基突变,但其致病性没有变化。 4.VSV-G假病毒的滴度从(?)3X105IU/ml (VSV△G-ANDV-GFP)到2×107IU/ml(VSV△G-VSV-GFP)。 VSV G-luc(?)段病毒颗粒与野生的VSV一样有着弹状外形,VSV△G-luc-HTNV平均长度为163.7±10.7nm,平均宽度为71.1±6.6nm。其它型别的假病毒大小与VSV A G-luc-HTNV.相似。 5.用抗汉滩型汉坦病毒的单克隆抗体(即抗Gc特异性单克隆抗体HCO2和11E10),抗VSV单克隆抗体mAb VSV,及SNV, ANDV和HTNV抗血清,分别与对应的汉坦病毒假病毒和原型分离株汉坦病毒反应,同一种抗体对两种病毒表现出相似的抑制效果。 6.抗SNV血清可以中和嵌合假病毒,对两个嵌合的假病毒的中和作用介于抗SNV和PHV假病毒之间。另外抗SNV血清对PHVMSNV中和作用比SNVMPHV稍强。 7. ReoPro可以同时减少致病性汉坦病毒和相对应的汉坦病毒假病毒进入Vero-E6细胞,紫外灭活的SNV和HTNV可以分别抑制SNV和HTNV假病毒进入细胞。 8.阿比朵尔可以特异性抑制汉坦病毒假病毒进入细胞。可以用流式细胞仪对HV004假病毒感染细胞后进行检测,从而有望用于高通量药物筛选。 结论： 1.湖北HFRS疫区流行一种新亚型HTNV,其很有可能是引起近年来HFRS流行的病原体。 2.汉坦病毒假病毒在抗原特征以及进入细胞方式上与原型分离株病毒相似,这为进一步研究汉坦病毒包膜蛋白与细胞的相互作用、病毒趋向性的研究以及应用于抗汉坦病毒药物的筛选提供了新的手段。
[Abstract]:Objective:
The study of hantavirus gene characteristics in Hubei area in recent years, and the construction of different hantavirus pseudo virus, thus provide a new way to further study the function of hantavirus G protein.
Method锛，

本文编号：1998198