鸡卵黄免疫球蛋白的分离纯化、mPEG修饰及其稳定性研究

发布时间：2018-06-16 15:33

  本文选题：鸡蛋 + 鸡卵黄免疫球蛋白　； 参考：《华中农业大学》2012年硕士论文

【摘要】：鸡卵黄免疫球蛋白,简称IgY (chicken egg yolk immunoglobulin),又称鸡卵黄抗体,是由血液中IgG被选择性地转移到卵黄中唯一的免疫球蛋白类。由于IgY是蛋白质类大分子,具有一定的免疫原性,当其用于机体时,会引发抗体产生而降低疗效,并且易受温度、酸碱、酶的影响,从而限制了IgY的应用领域。本文针对这一问题,制备了mPEG化IgY,主要研究内容为：鸡IgY分离纯化,nPEG化学修饰,以及修饰前后的IgY稳定性进行对比研究。研究结果如下： 1.建立了一种高效、经济、大规模分离纯化鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的生产方法,即在对传统水稀释法改良的基础上,结合聚乙二醇沉淀与离子交换色谱进行IgY的分离纯化。具体工艺为新鲜鸡蛋经过分离得到蛋黄液,经水稀释后,离心得上清液,向上清液中加入PEG6000沉淀蛋白,沉淀物经透析、冷冻干燥之后经过一步离子交换法进行纯化,并对具体工艺条件进行了优化。实验结果显示,用8倍无菌水稀释蛋黄液,用0.1mol/L HCl调节pH为5.2,在4℃下静置8h,于5000×g力离心可得上清粗IgY,经测定回收率可达93.47%。然后用6%聚乙二醇沉淀后经DEAE-Toyopearl650M离子交换纯化,最佳的纯化条件：0.05mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7)平衡上样,0.075mol/L PBS (pH7)洗脱。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果显示所得的IgY的纯度为95%,活性保持率高达73.77%。本研究弥补了传统分离方法不能同时达到高纯度和高回收率的缺点,且可用于大规模生产。 2.研究了单甲氧基聚乙二醇(mPEG)对鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的化学修饰,并通过傅里叶变换红外光谱、圆二色光谱和荧光光谱分析比较了修饰前后IgY的稳定性。具体修饰方法为：mPEG经NHS活化,得NHS-mPEG,冷冻干燥,NHS-mPEG对IgY进行化学修饰,得iPEG-IgY。 mPEG对IgY进行修饰过程中,通过对各种修饰条件的摸索和比较优化,最后筛选出mPEG最佳修饰反应条件为：IgY与活化后的nPEG按摩尔比1：10,pH7条件下反应1h可得修饰率为20.56%的mPEG-IgY,IgY活性保持率可达90%。修饰前的IgY二级结构中a-Helix、β-sheet、β-Turn、Random分别为14.5%、42.1%、6.2%、37.2%；修饰后的mPEG-IgY各二级结构含量分别为9.1%、44.9%、7.4%、38.6%。与修饰前相比,nPEG-IgY的α-螺旋含量降低了约37%,p-螺旋含量升高,其他含量变化不明显。 3.通过光谱分析法对IgY以及mPEG-IgY的热稳定性进行了研究。结果显示,70℃温育120min后,IgY的α-Helix、β-sheet、β-Turn、Random各二级结构含量由14.5%、42.1%、6.2%、37.2%变为1.6%、55.25%、5.8%、37.5%；mPEG-IgY的各二级结构含量由12.9%、42.7%、6.3%、38.1%变为3.1%、50.5%、7.2%、39.2%。热动力学分析表明,IgY热变性反应级数为1级,在65、70、75、80、85、90℃加热条件下,D值分别为：166.67、37.59、6.48、2.92、1.79、1.13min；此温度范围内的Z值为11.5℃,表观活化能Ea=200.841kJ/mol,焓值分别为198.0296、197.988、197.9465、197.9049、197.8633、197.8218kJ/mol,熵值分别为58.66751、58.65283、58.63837、58.62411、58.59619kJ/(mol·K),吉普斯自由能分别为33.09298、30.65444、28.2166、25.77931、23.34261、20.90646kJ/mo。 mPEG-IgY热变性反应级数为1级,在65、70、75、80、85、90℃加热条件下,D值分别为：208.33、60.61、8.02、4.48、2.50、2.18min;此温度范围内的Z值为12.22℃,表观活化能Ea=186.915kJ/mol,焓值分别为84.1036、184.0621、184.0205、183.9789、183.9373、183.5958kJ/mol,熵值分别为53.50651、53.49183、53.47737、53.62411、58.61005、58.59619kJ/(mol·K),吉普斯自由能分别为33.67654、31.45257、29.2292、27.00644、24.78425、22.26271kJ/mol。 4.对IgY以及mPEG-IgY不同酸碱条件下的稳定性进行了研究。结果显示,在4h、pH11条件下：nPEG-IgY活性保持率比IgY活性保持率高接近五倍。圆二色光谱扫描分析显示,在pH4处理条件下,IgY的α螺旋含量降低了76.4%,而修饰后的IgY降幅减少15.7%；IgY以及mPEG-IgY的β折叠含量均有所增高,增幅分别为18.4%和29.7%。在pH11条件下圆二色光谱扫描结果为IgY的α螺旋含量降低了71.1%,而修饰后的IgY降幅减少14.9%；IgY以及mPEG-IgY的β折叠含量均有所增高,增幅分别为16.5%和21.7%。说明IgY经过mPEG修饰以后所得产物对酸碱有着更高的耐受力。 5.对IgY以及nPEG-IgY在模拟胃肠液消化系统中的稳定性进行了研究。结果显示,在pH4的模拟胃液消化过程中,反应30～45min时间段内,IgY活性保持率由83.57%变为55.59%,活性降低28.08%；mPEG-IgY活性保持率由89.81%变为72.63%,活性降低17.18%。反应90～120min时间段内,IgY活性保持率由46.24%变为31.33%,活性降低14.91%；mPEG-IgY活性保持率由63.21%变为60.44%,活性降低2.77%。pH2条件下,对比IgY以及mPEG-IgY活性保持率可以发现,反应30～45min时间段内,IgY活性保持率由71.69%变为50.37%,活性降低21.32%；mPEG-IgY活性保持率由83.33%变为65.25%,活性降低18.08%。反应90～120min时间段内,IgY活性保持率由41.36%变为20.69%,活性降低20.67%；mPEG-IgY活性保持率由55.49%变为49.82%,活性降低5.67%。氨基酸成分分析结果显示,修饰前以及修饰后的IgY,氨基酸成分以及含量基本一致,说明IgY在经过nPEG修饰之后一级结构并没有被破坏。寡肽成分分析结果表明,经消化液酶解后,mPEG-IgY寡肽的种类和数量减少,说明经IgY过修饰后比修饰前有着更强的胃蛋白酶、胰蛋白酶稳定性。因此可知经过修饰后的IgY比没有修饰的天然IgY有着更强的胃蛋白酶、胰蛋白酶稳定性。
[Abstract]:Chicken egg yolk immune globulin , also known as chicken egg yolk antibody , is the only immunoglobulin class which is selectively transferred from blood to egg yolk .

1 . An efficient , economical and large - scale separation and purification of egg yolk immune globulin ( igy ) was established . The separation and purification were carried out on the basis of the improvement of traditional water dilution method . The specific process was that fresh eggs were separated to obtain egg yolk liquid . After being diluted with water , the supernatant was purified by one - step ion exchange method . The results showed that the purity of the obtained igy was 95 % and the activity retention rate was 73.77 % . The results showed that the traditional separation method could not achieve the defects of high purity and high recovery rate , and could be used for mass production .

2 . The chemical modification of egg yolk immunoglobulin by single methoxy polyethylene glycol ( mPEG ) was studied . The stability of the modified igy was compared by FTIR , circular dichroism and fluorescence spectrum analysis .
The content of the secondary structures of the modified mPEG - igy was 9.1 % , 44.9 % , 7.4 % and 38.6 % , respectively .

3 . The thermal stability of igy and mPEG - gy was studied by spectral analysis . The results showed that after incubation for 120 min at 70 鈩，

本文编号：2027180