维生素C体外诱导小鼠iPSc分化为心肌细胞的作用

发布时间：2018-06-26 05:49

  本文选题：维生素C + 小鼠诱导多能干细胞　； 参考：《重庆医科大学》2011年硕士论文

【摘要】：目的:探讨维生素C作为诱导剂对小鼠诱导多能干细胞(miPSc)体外分化为心肌细胞的影响。 方法:1.复苏miPSc,从细胞形态、干细胞全能性基因Oct-4的表达及碱性磷酸酶染色鉴定其全能性。比较不同差速贴壁时间去除饲养层细胞后对悬滴法形成规则拟胚体(EBs)数量的影响;比较不同细胞接种浓度对直接悬浮法形成规则EBs数量的影响。观察由miPSc形成的EBs的体外发育过程的形态学改变。 2.比较含不同摩尔浓度的维生素C的分化培养液(10~(-3)mol/l,10~(-4) mol/l,10~(-5) mol/l,10~(-6) mol/l)对悬浮法得到的EBs分化为心肌细胞的效率的差别,并对分化出的搏动区域进行心肌细胞特异性蛋白cTnT及α-actin的鉴定。用Percoll密度梯度离心法对EBs分化而来的细胞进行心肌细胞的分离和提纯,并行心肌特异性蛋白cTnT和α-actin的鉴定。 结果:1.光镜下iPSc呈集落样生长,似鸟巢。荧光显微镜下,iPSc集落团发出明暗相间的绿色荧光(Oct-4启动),碱性磷酸酶染色结果显示我们培养的iPSc集落团着深蓝色。 2.用悬滴-悬浮两步法制作EBs,在差速贴壁15min,30min,60min以及90min去除饲养层后,以差速贴壁60min的效果最好,规则EBs的比率达67.82±5.10~%,与其它各组比较差异有显著性(P0.05)。 3.用悬浮一步法制作EBs,调整细胞密度为10~3/ml,10~4 /ml ,10~5/ml ,10~6/ml四个组接种。各组均以悬浮培养第四天观察到的EBs个数达高峰,以10~4/ml密度接种的那组EB最多为171.67±3.51个,与其它各组相比差异有显著性(P0.05)。 4.维生素C诱导miPSc分化为心肌细胞的最佳浓度为10~(-4)mol/l,约为57.00±3.20%的EBs出现搏动,显著高于不添加任何诱导剂的对照组5.13±0.55%(P0.01)。诱导而来的心肌细胞表达心肌特异性蛋白cTnT以及α-actin。 5.Percoll密度梯度离心法将诱导分化而来细胞分为了四层,以第三和第四层心肌细胞比例最高,分别为26±1%和60±2%,明显多于第一层3±1%和第二层5±1%(P0.05)。分化而来的心肌细胞表达心肌特异性蛋白cTnT以及α-actin。 结论: 1.用维生素C作为诱导剂能显著提高iPSc源的EBs分化为心肌细胞的效率; 3.利用Percoll密度梯度离心法可以将iPSc诱导而来的心肌细胞单独分离出来。
[Abstract]:Aim: to investigate the effect of vitamin C as an inducer on the differentiation of mouse induced pluripotent stem cells (miPSc) into cardiomyocytes in vitro. Method 1: 1. MiPSc was resuscitated to identify its totipotency from cell morphology, expression of stem cell totipotent gene Oct-4 and alkaline phosphatase staining. To compare the effect of different attachment time on the number of regular embryoid body (EBs) formed by suspension method and the effect of different cell inoculation concentration on the number of regular EBs formed by direct suspension method. The morphological changes of EBs formed by miPSc in vitro were observed. 2. The effects of 10 ~ (-3) mol / L ~ (-4) mol / L ~ (-5) mol / L ~ (-10) ~ (-6) mol/l on the differentiation of EBs into cardiomyocytes were compared, and the specific proteins cTnT and 伪 -actin were identified. Cardiomyocytes derived from EBs were isolated and purified by Percoll density gradient centrifugation, and the myocardial specific proteins cTnT and 伪 -actin were identified. The result is 1: 1. Under the light microscope, iPSc grew like a bird's nest. Under the fluorescence microscope, the colony of iPSc produced green fluorescence (Oct-4 priming), and the result of alkaline phosphatase staining showed that the colony of iPSc was dark blue. 2. EBs were made by suspension and suspension two-step method. After 15 mins, 30mins, 60min, and 90min removed the feeding layer, the best effect was achieved with the ratio of regular EBs to 67.82 卤5.10m, which was significantly different from that of other groups (P0.05). The results were as follows: (1) the rate of 60min was better than that of other groups (P < 0.05), and the rate of regular EBs was 67.82 卤5.10% (P < 0.05). EBswere prepared by suspension one-step method, and the cell density was adjusted to 10 ~ 3 / ml ~ (10 ~ 4) / ml ~ (10 ~ 5) / ml ~ (10 ~ (6) / ml) inoculation in four groups. The number of EBs observed in each group reached the peak on the fourth day of suspension culture, and the maximum number of EB in the group inoculated with 10~4/ml density was 171.67 卤3.51, which was significantly different from other groups (P0.05). The optimal concentration of vitamin C to induce miPSc differentiation into cardiomyocytes was 10 ~ (-4) mol / L, about 57.00 卤3.20% EBs appeared pulsatility, which was significantly higher than that of the control group (5.13 卤0.55%) without any inducer (P0.01). The induced cardiomyocytes expressed myocardial specific protein cTnT and 伪 -actin.5.Percoll density gradient centrifugation divided the induced differentiated cells into four layers, with the third and fourth layers being the highest. It was 26 卤1% and 60 卤2% respectively, which was significantly higher than that in the first layer (3 卤1%) and the second layer (5 卤1%) (P0.05). The differentiated cardiomyocytes express myocardial specific protein cTnT and 伪-actinin. Conclusion: 1. Vitamin C as inducer could significantly improve the differentiation efficiency of iPSc derived EBs into cardiomyocytes. 3. Isolated cardiomyocytes induced by iPSc could be isolated by Percoll density gradient centrifugation.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

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本文编号：2069389