重组钙网蛋白免疫生物学功能关键结构域的研究

发布时间：2018-11-20 18:39

【摘要】：钙网蛋白（calreticulin，CRT）是一种主要存在于真核细胞内质网中的Ca~(2+)结合蛋白，对维持细胞内Ca~(2+)稳态起主要作用[1,2]。CRT分子由三个结构域（N domain、P domain、C domain）和C末端驻留在内质网内的四个氨基酸序列KEDL组成[1,2]。钙网蛋白凝集素样球状N domain（氨基酸序列：18-197）后面连着富含脯氨酸的Pdomain（氨基酸序列：198-308）和结合Ca~(2+)的C domain[1,3-5]。与热休克蛋白相似，钙网蛋白也是内质网内的分子伴侣蛋白，协助内质网内蛋白的加工和MHCⅠ分子的正确折叠[2,5,6]。 虽然钙网蛋白主要存在于细胞内，但也可以出现在各种类型的细胞表面，并在细胞和细胞之间、细胞与细胞基质之间发挥作用[6-8]。钙网蛋白还可出现在各种类型的免疫细胞膜表面，包括单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞和DC细胞，从而在诱导细胞成熟，清除凋亡细胞和肿瘤细胞中发挥重要作用[9-12]。暴露在肿瘤细胞和凋亡细胞膜表面的钙网蛋白可以增加这些细胞的免疫原性，使得这些细胞更容易被识别并被更有效地吞噬[13-16]。然而，这一现象的分子机制不是完全清楚。我们推断钙网蛋白主要是由N domain而不是C domain发挥免疫生物学功能。因为前者具有凝集素样功能并且能高效亲和各种糖基化蛋白质分子[3-5]。 为了探究钙网蛋白免疫生物学功能的关键结构域，我们原核表达了鼠源钙网蛋白相关片段，，包括rCRT/N domain、rCRT/120-250、rCRT/120-308、rCRT/251-360、rCRT/C domain。其中rCRT/N domain、rCRT/120-250、rCRT/120-308是用His6作为标签纯化得到的（rCRT/N domain主要分布在包涵体中，故从包涵体中纯化）。rCRT/251-360和rCRT/C domain用GST作为标签纯化。在纯化过程中，我们发现rCRT/N domain蛋白浓度较低。rCRT/251-360和rCRT/C domain蛋白纯度差，极容易降解。 Native-PAGE分析显示rCRT/N domain、rCRT/251-360和rCRT/C domain均无法形成二聚体和多聚体结构。rCRT/120-250和rCRT/120-308均可以刺激C57BL/6小鼠脾细胞增殖并分泌细胞因子IL-6。rCRT/120-250和rCRT/120-308还可刺激C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO和细胞因子TNFα且刺激强度与full-lengthCRT（FL-CRT）和rCRT/39-272相当。重组片段蛋白免疫BALB/c小鼠，血清动力学分析显示rCRT/120-250和rCRT/120-308相对于其他重组蛋白可更好地产生高滴度的特异性抗体。 综上所述，rCRT/120-250是FL-CRT发挥免疫生物学功能的关键结构域。rCRT/120-250免疫生物学功能以及免疫原性可能与其形成二聚体及多聚体结构有关。
[Abstract]:Calmodulin (calreticulin,CRT) is a Ca~ (2) binding protein mainly present in the endoplasmic reticulum of eukaryotic cells, which plays a major role in maintaining the homeostasis of intracellular Ca~ (2). CRT molecules consist of three domains (N domain,P domain,). Four amino acid sequence KEDL at the end of C domain) and C terminal in endoplasmic reticulum (ER) consist of [1]. Calcium reticulin-like globular N domain (amino acid sequence: 18-197) followed by proline rich Pdomain (amino acid sequence: 198-308) and Ca~ (2) binding C domain [1: 3-5]. Similar to heat shock proteins, calmodulin is also a molecular chaperone in the endoplasmic reticulum, which facilitates the processing of endoplasmic reticulum proteins and the correct folding of MHC 鈪

本文编号：2345667