埃博霉素B的制备分析及PEG修饰

发布时间：2019-02-18 18:26

【摘要】：埃博霉素（Epothilones）是粘细菌（Myxobacteria）纤维堆囊菌（Sorangiumcellulosum）产生的十六元的大环内酯类次级代谢产物。埃博霉素与目前临床常用的抗肿瘤化疗药物紫杉醇具有相似的稳定微管的作用机理，并且埃博霉素的抗肿瘤谱更广，不受P-糖蛋白作用，对多药耐药（包括对紫杉醇耐药）的细胞系均有抑制作用。埃博霉素内酰胺衍生物Ixabepilone已经被FDA批准用于治疗乳腺癌和卵巢癌等。本文对埃博霉素的提取，分离进行优化。粘细菌发酵液用大孔树脂吸附后，将树脂填柱，用不同浓度的乙醇溶液解吸附，所得的吸附液真空旋转蒸发至小体积，得到粗提取，粗提物用甲醇复溶后，经高效液相检测分析，对梯度洗脱液进行优化。最后确定用50%以上的乙醇溶液梯度洗脱，减少了洗脱时间和溶液的用量。经乙醇洗脱后的溶液采用葡聚糖凝胶LH-20进行分离，在经过高效液相色谱的制备得到目标产物埃博霉素B，所得的纯品与标准品进行薄层层析比对，参照核磁共振波谱确证其结构，与文献报道一致。采用UPLC-Q-TOF/MS对埃博霉素B（Epothilone B）纯化产品及粘细菌发酵液提取物进行分析。运用ACQUITY HSS T3超高效液相色谱柱（2.1×50mm，1.8μm），，以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱；质谱使用ESI离子源，负离子模式下采集数据。结果运用UPLC-Q-TOF/MS方法可以检测到埃博霉素B纯化产品中的微量杂质以及发酵液提取物中主要产物。UPLC-Q-TOF/MS方法操作简单，快捷，可作为埃博霉素B的有效检测方法。由于埃博霉素是抗肿瘤化疗药物，具有一定的细胞毒性，能够引起胃肠道反应以及骨髓抑制等毒副作用，因此对埃博霉素进行修饰以降低其毒副作用，抗肿瘤小分子药物可采用高分子聚合材料修饰来降低其毒副作用。本文以埃博霉素B为起始原料，选用分子量为5000和20000的聚乙二醇（PEG）和埃博霉素进行偶联。选择的聚乙二醇为一端甲氧基化，另一端为羧基化的聚乙二醇（M-PEG-COOH），通过DCC缩合及DMAP催化，选择性酯化7-OH。将聚乙二醇与埃博霉素B相连接，产物经TLC，1H-NMR确认结构，使用MALDI/TOF-MS测定产物的分子量，确证1分子Epothilone B与1分子PEG相连接。对PEG偶联得到的化合物进行初步的体外细胞实验检测活性：使用人乳腺癌细胞MCF-7，用半数有效抑制浓度（IC50）表示抗癌效应。具体结果为：MPEG5000-Epo B的IC50为0.57μM，MPEG20000-Epo B IC50为8.4×10-3μM。结果表明，PEG偶联物对MCF-7人体乳腺癌细胞增殖均有抑制作用，PEG分子量20000偶联物的MCF-7的抑制作用较强。本文对埃博霉素B的提取制备进行优化，选择乙醇做洗脱剂为工业化奠定基础，对埃博霉素B纯化产品及粘细菌发酵液提取物进行UPLC-Q-TOF/MS分析，对于控制产品的质量以及改进工艺，提高代谢物产量具有重要的指导意义，也可用于筛选高产菌株。使用聚乙二醇对埃博霉素B进行修饰得到的产物均具有活性，为进一步的埃博霉素B衍生化做了初步探索。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

【参考文献】