1、Runx2甲基化状态变化对血管平滑肌细胞成骨样分化影响的研究 2、Vaspin对人成骨细胞凋亡的作用机制研究

发布时间：2019-04-19 06:13

【摘要】：目的构建体外定向诱导的小鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)向成骨样细胞分化的细胞模型,为本系列研究奠定基础。 方法VSMC使用含10mMβ-甘油磷酸钠(P-glycerophosphate disodium, β-GP)的培养基培养,定向诱导原代小鼠VSMC分化为成骨样细胞,在细胞培养的0天、12天分别提取总RNA做逆转录,荧光实时定量PCR检测Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2, Runx2)、骨钙素(osteocalcin, OC)、骨桥蛋白(osteopontin, OPN) mRNA的表达水平；检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性；进行矿化结节染色。分别在细胞培养的0天、3天、8天、12天提取总蛋白做Western Blot,观察平滑肌细胞标志物平滑肌肌动蛋白a (smooth muscle alpha-actin, SMα-actin)及Runx2蛋白的表达情况。 结果VSMC经过12天诱导后,β-GP可增强Runx2、OC、OPN mRNA的表达,提高ALP活性,促进矿化结节的形成,增强Runx2蛋白的表达,并抑制SMa-actin蛋白的表达。 结论本研究成功构建了小鼠VSMC成骨样分化的细胞模型。β-GP增强成骨细胞表型基因Runx2、OC、OPN mRNA表达；增强Runx2蛋白表达；抑制平滑肌细胞表型标志物SMa-actin蛋白表达。β-GP的诱导作用具有时间依赖性特征。 目的检测VSMC成骨样分化前后以及5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)干预后Runx2基因启动子的甲基化状态,观察5-Aza-dC对VSMC成骨样分化过程中Runx2表达的影响,探讨Runx2甲基化状态影响VSMC成骨样分化过程的机制。 方法提取对照组VSMC的DNA,通过亚硫酸氢钠测序,确定Runx2基因启动子的甲基化状态。用MTT法检测5-Aza-dC对VSMC增殖的影响,获得适宜的干预浓度。将小鼠VSMC暴露于含有不同浓度的5-Aza-dC矿化培养基中培养12天,分别抽提VSMC的总RNA和总蛋白,观察Runx2在mRNA及蛋白水平的表达情况；用含相同浓度5-Aza-dC(15μM)的矿化培养基干预VSMC,在细胞培养的0天、3天、8天和12天分别抽提总RNA做逆转录,荧光实时定量PCR观察Runx2mRNA表达情况,Western Blot观察Runx2在蛋白水平的表达。 分别提取10mM β-GP诱导12天及15μM5-Aza-dC联合10mM P-GP干预12天VSMC的DNA,通过亚硫酸氢钠测序,确定Runx2基因启动子的甲基化状态。 结果对照组VSMC的Runx2基因启动子呈高甲基化状态。20μM5-Aza-dC干预VSMC24小时后,细胞密度较对照组显著降低(P0.05)。低于20μM的5-Aza-dC(5,10,15μM)是适宜的干预浓度并用于后续的研究o5-Aza-dC上调VSMC的Runx2表达,且对Runx2表达的影响呈剂量和时间依赖效应,5-Aza-dC干预的最佳浓度为15μM。 亚硫酸氢钠测序结果显示,10mM β-GP诱导12天后,Runx2基因启动子甲基化水平较对照组明显降低；15μM5-Aza-dC联合10mM β-GP干预12天后,Runx2基因启动子甲基化水平较诱导组和对照组均显著降低。 结论VSMC向成骨样细胞分化后,Runx2基因启动子甲基化水平降低；5-Aza-dC干预后,Runx2基因启动子甲基化水平进一步降低。5-Aza-dC通过降低Runx2基因启动子甲基化水平,上调Runx2的表达,呈现剂量和时间依赖效应。Runx2基因启动子去甲基化可能促进VSMC成骨样分化。 目的vaspin(visceral adipose tissue-derived serpin)是一种新近发现的由内脏脂肪组织分泌的脂肪因子,具有增强胰岛素敏感性的作用。近期的研究发现vaspin通过PI3-K/Akt信号转导通路抑制血管内皮细胞的凋亡。但vaspin的主要生理作用及相关机制仍不明确。本研究首次检测vaspin对人成骨细胞(human osteoblast, hOB)凋亡的影响,并探讨vaspin对hOB凋亡的作用机制。 方法用ELISA法和TUNEL法测定hOB凋亡情况。应用Western blot分析vaspin对hOB细胞Bcl-2及Bax蛋白表达的影响。应用Western blot检测vaspin干预后p-ERK1/2, ERK1/2, p-JNK, JNK, p-p38, p38, p-Akt和Akt的表达。用ERK信号转导阻断剂PD98059干预,观察vaspin对hOB凋亡的作用及信号转导的影响。 结果(1)vaspin可抑制hOB凋亡。(2)vaspin促进Bcl-2蛋白表达,抑制Bax蛋白表达,均呈现剂量依赖效应。(3)vaspin干预可诱导ERK磷酸化,MAPK/ERK信号转导阻断剂PD98059能阻断vaspin对ERK的活化作用；vaspin对p38、JNK和Akt磷酸化无影响。(4)PD98059能抑制vaspin对hOB凋亡的抑制作用。 结论vaspin通过MAPK/ERK信号转导通路抑制hOB凋亡
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329.2

【参考文献】

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本文编号：2460672