应用LCM技术对早期流产组织胚胎成份分离检验

发布时间：2019-04-26 08:57

【摘要】：第一部分激光捕获显微切割技术诊断石蜡切片中早期胚胎成份与亲权关系的研究目的：法医生物物证的发现和提取是犯罪现场勘验中非常重要的一项任务，而实验室检验过程中混合检材的分离处理以及微量物证的检出也是十分关键的技术问题。本研究正是为解决实际检案中这样一些困难，以获取一种新的技术方法为目的，从而为扩大犯罪现场检材的检测范围、充分挖掘各类案件检材的证据价值发挥重要作用。如在法庭科学实验室解决性侵犯案件和亲子鉴定案件中，经常会遇到早期胚胎流产的情况，在被害人怀孕3个月内进行流产手术，母体成份与胎儿成份难以有效分离，微量的母亲成份会导致混合谱带或分型失败，此类样品是性侵犯案件或怀孕妇女自杀案件中经常遇到的检材，往往只能给出模糊结论，不能成为直接认定的证据，这样就不能充分发挥生物检材的证据价值。本研究针对法医物证鉴定和亲子关系确认中，对早期流产组织中母体与胚胎成份混合导致的母体与胚胎混合分型困难的问题，通过激光捕获显微切割技术捕获石蜡切片中胚胎绒毛细胞,进行低体积扩增，实现胚胎个体分型,证实亲子关系。方法：新鲜流产组织通过福尔马林固定、石蜡包埋制成石蜡切片通过激光捕获显微切割技术捕获石蜡切片上胚胎绒毛细胞，设置 20,30,40个细胞数目组。将捕获的不同数目绒毛细胞，PK蛋白酶裂解，利用低体积扩增仪进行1.5μL体系PCR扩增，通过3130遗传分析仪得出胚胎个体分型图谱，，并比较各细胞数目组胚胎个体识别的检出率、等位基因丢失率和非特异性扩增情况，最后进行实际案例应用。结果：最少捕获石蜡切片上20个胚胎绒毛细胞即可获得胚胎个体分型。40个细胞数目组的胚胎个体分型检出率高，等位基因丢失率和非特异性扩增率低。20个细胞数目组的胚胎个体分型检出率低，等位基因丢失率和非特异性扩增率高。结论：激光捕获显微切割技术结合低体积扩增技术可应用于石蜡切片，实现胚胎与母体成份的精确分离并确证亲权关系。第二部分应用LCM技术对早期流产组织冰冻切片中胚胎成份的分离检验目的：冰冻切片、石蜡切片皆可用于激光捕获显微切割技术，但石蜡组织切片因前期的处理可能使核酸的结构受到一些破坏，通过捕获较少的细胞通常难以获得大片段等位基因，而冰冻组织切片能够较好的保存核酸的完整性。本研究旨在通过激光捕获显微切割技术结合低体积扩增技术捕获冰冻切片上较少的绒毛细胞来实现胚胎与母体成份的精确分离并确证亲权关系，从而寻找一种新的技术方法。方法：制备早期流产组织冰冻切片，通过激光捕获显微切割技术捕获胚胎绒毛细胞，设置10,20,30个细胞数目梯度。将捕获的不同数目绒毛细胞，PK蛋白酶裂解，利用低体积扩增仪进行1.5μL体系PCR扩增，通过3130遗传分析仪得出胚胎个体分型图谱，并比较各细胞数目组胚胎个体识别的检出率、等位基因丢失率和非特异性扩增情况，最后进行模拟案例检验。结果：最少捕获10个胚胎绒毛细胞即可获得完整的胚胎STR-DNA分型。冰冻切片捕获30个细胞数目组的胚胎分型检出率高，等位基因丢失率和非特异性扩增率低，捕获10个细胞数目组的胚胎分型检出率低，等位基因丢失率和非特异性扩增率高。结论：激光捕获显微切割技术联用低体积扩增技术可应用于胚胎与母体成分DNA的精确分离和检验，最少捕获10个胚胎绒毛细胞即可获得完整的胚胎STR-DNA分型，确证亲权关系。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R321

【参考文献】