hTGF-β1、hBMP-2基因修饰骨髓间充质干细胞生物学特性的实验研究

发布时间：2019-06-21 09:31

【摘要】：目的:(1)在明确人转化生长因子β(hTGF-β)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向骨组织细胞分化作用的基础上,基于转基因技术实现BMSCs的hTGF-β1基因修饰;(2)研究hTGF-β1联合hBMP-2协同诱导BMSCs成骨作用的影响,阐明其成为理想骨组织工程种子细胞价值。 方法:1.利用基因同源重组原理,通过AdMax腺病毒系统构建hTGF-β1重组腺病毒,以及对照组病毒pAdMax-EGFP-3FLAG. 2.目的基因修饰的骨髓间充质干细胞的建立:(1)采用差速贴壁传代筛选法和流式细胞鉴定相结合,分离培养大鼠骨髓间充质干细胞;(2)通过腺病毒载体介导hTGF-β1基因转染BMSCs,分别通过荧光显微镜观察荧光表达情况,确定最佳感染复数;(3)RT-PCR检测转染后BMSCs中hTGF-β1的表达情况;ELISA检测转染细胞培养上清中目的蛋白的表达。 3.双基因修饰的BMSCs细胞生物学特性分析:将外源基因修饰的BMSCs分为5组:A.正常MSCs组;B.空病毒修饰组;C.hBMP-2修饰组;D.hTGF-β1修饰组;E.hTGF-β1+ hBMP-2修饰组。 (1)采用MTT法测定各组细胞增殖能力; (2)酶促反应检测细胞碱性磷酸酶活性。 结果:(1)成功将hTGF-β1基因导入表达载体pAV-MCMV-EGFP-3FLAG中,构建了重组腺病毒Ad-hTGF-β1,DNA测序证明,所克隆目的基因序列与Genebank收录一致。 (2)通过结合贴壁培养法和流式细胞鉴定高效、快速的分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并通过GFP荧光表达提示目的基因存在于所转染的细胞中;RT-PCR显示转染细胞中有大量目的基因mRNA转录;ELISA结果显示转染细胞胞浆中有目的蛋白的表达。 (3)不同基因修饰后的MSCs增殖能力均得到不同程度的增强,其中hTGF-β1和hBMP-2共同修饰对促进MSCs的增殖能力最明显;ELISA检测显示双转组中MSCs的ALP活性明显高于各单转组。 结论:(1)利用新的AdMax腺病毒载体转染方法可使骨髓间充质干细胞高效稳定地表达hTGF-β1及hBMP-2基因; (2)利用两种基因间的协同作用,联合应用hTGF-β1和hBMP-2可明显促进组织工程骨种子细胞的成骨化,效果优于单用一种生长因子。
[Abstract]:Aim: (1) based on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) induced by human transforming growth factor 尾 (hTGF- 尾) into bone tissue cells, the hTGF- 尾 1 gene modification of BMSCs was realized based on transgenic technology. (2) to study the effect of hTGF- 尾 1 combined with hBMP-2 on BMSCs osteogenesis, and to elucidate its value as an ideal seed cell of bone tissue engineering. Method: 1. Based on the principle of gene homologous recombination, hTGF- 尾 1 recombinant adenoviruses and control virus pAdMax-EGFP-3FLAG. were constructed by AdMax adenoviral system. two銆，

本文编号：2503968