沙眼衣原体Ahpc基因克隆表达及过氧化物酶活性分析

发布时间：2017-03-15 22:02

  本文关键词：沙眼衣原体Ahpc基因克隆表达及过氧化物酶活性分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:研究沙眼衣原体(C.trachomatis,Ct)感染是否引起巨噬细胞氧化损伤,分析Ct0866(烷基氢过氧化物还原酶,Ahpc)基因在感染过程中的表达及其在Ct抗氧化胁迫中起作用,为了解Ct的抗氧化机制提供实验基础。方法:将Ct感染巨噬细胞,并在0h、3h、6h、9h和12h收集细胞,荧光法检测细胞内ROS的水平,Realtime-PCR检测Ahpc基因在感染不同时间的变化情况。以Ct DNA为模板,PCR法扩增Ahpc基因,将其克隆到pET28a载体。经鉴定后将其转化至表达菌E.coli BL21,利用IPTG诱导目的蛋白的表达。采用SDS-PAGE对表达产物进行分析并纯化重组Ahpc蛋白;采用氧化铁二甲酚橙法检测Ahpc蛋白的氢过氧化物酶活性。测定Ahpc蛋白表达的转基因菌和对照菌在百草枯胁迫下的生长曲线。结果:(1)荧光结果显示Ct感染能够诱导巨噬细胞产生ROS,发现在3h时候其荧光值为1980±310,6h的荧光值为4260±350并且达到高峰,在9h时为2900±245,12h时为2100±250。(2)Ct感染过程中,Ahpc基因的表达上调,在3h时为初始的7.3倍,6h为初始的8.2倍,达到了高峰,然后开始下降,9h时为初始的5.2倍,12h为4.5倍。(3)成功扩增获得大小为588 bp的Ahpc基因,所构建的原核重组质粒pET28a-Ahpc经PCR和测序鉴定与预期目的基因相符。(4)利用IPTG成功诱导Ahpc蛋白的表达,SDS结果发现重组菌能够表达分子约为26kDa的蛋白质,并通过Ni2+亲和层析法纯化获得纯度较高的重组Ahpc蛋白。(5)Ahpc蛋白能够降解叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)和H2O2。(6)在百草枯引起的氧化应激条件下,转化pET28a-Ahpc表达载体的大肠杆菌生长要强于对照菌(转化了空载体pET28a)。结论:Ct感染会导致巨噬细胞产生氧化应激;Ahpc在Ct感染过程中表达上调;Ahpc蛋白具有氢过氧化物酶活性和能够赋予大肠杆菌抵抗氧化胁迫的能力。
【关键词】：沙眼衣原体 烷基氢过氧化物还原酶 活性氧 叔丁基过氧化氢
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R374.1
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 主要英文缩略语索引9-10
• 第1章 前言10-12
• 第2章 材料和方法12-24
• 第3章 结果24-30
• 第4章 讨论30-34
• 结论34-36
• 参考文献36-40
• 文献综述40-52
• 参考文献47-52
• 附录52-54
• 攻读学位期间发表论文54-56
• 本研究受以下基金资助56-58
• 致谢58

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本文编号：251026