人源脂联素及其受体的表达纯化和两者间相互作用的研究

发布时间：2017-03-16 02:01

  本文关键词：人源脂联素及其受体的表达纯化和两者间相互作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脂肪细胞分泌表达的脂联素能够识别、结合肝脏或骨骼肌中的脂联素受体,通过下游AMPK、PPARα等途径刺激葡糖糖摄取和脂肪酸氧化,维持体内能量稳态,发挥胰岛素增敏作用。脂联素及其受体代谢或功能异常导致机体多种疾病的发生,如胰岛素耐受、肥胖、动脉粥样硬化等等,恢复其含量或功能能够有效缓解各类疾病。因此,脂联素及其受体成为治疗胰岛素耐受等疾病的全新重要靶点。在体内,脂联素球形结构域部分能够结合肝中Adip R1,形成配体-受体复合物,但两者间相互作用机制尚不清楚。本文构建了脂联素(104-244)原核及昆虫细胞表达系统,鉴定及筛选了表达纯化克隆,通过亲和纯化得到带有GST或MBP融合蛋白的脂联素蛋白及经PPase和TEV水解去除融合蛋白后单独的脂联素蛋白,并对蛋白蛋白行为进行分子筛分析。结果显示,试验纯化的到的脂联素蛋白在自然条件下能形成二聚体。构建了脂联素受体1三种截短体(22-375、72-37、89-375)蛋白昆虫细胞表达系统,优化蛋白表达及纯化条件,纯化得到三种截短体蛋白。结果显示,部分脂联素受体1蛋白能够通过二硫键形成二聚体。在得到蛋白的基础上,通过分子筛层析及GST-Pull down、Ni-Pull down进行了两种蛋白相互作用的研究,结果表明,原核及昆虫表达系统得到的脂联素蛋白与昆虫表达系统得到的脂联素受体1蛋白无明显的相互作用。
【关键词】：脂联素 脂联素受体 蛋白纯化 相互作用
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-7
• 第1章 绪论7-21
• 1.1 课题研究的目的和意义7-8
• 1.2 脂联素蛋白结构与功能8-11
• 1.2.1 脂联素蛋白8
• 1.2.2 脂联素蛋白结构8-9
• 1.2.3 脂联素蛋白功能9-11
• 1.3 脂联素受体蛋白结构与功能11-13
• 1.3.1 脂联素受体蛋白11
• 1.3.2 脂联素受体蛋白结构11-12
• 1.3.3 脂联素受体蛋白功能12-13
• 1.4 脂联素功能信号机制13-17
• 1.4.1 脂联素功能的研究13-14
• 1.4.2 脂联素信号传导的三条途径14-17
• 1.4.3 脂联素基因多态性对脂联素功能的影响17
• 1.5 针对脂联素-脂联素受体进行的治疗研究17-18
• 1.5.1 脂联素假说17
• 1.5.2 脂联素及其受体类似物的研究17-18
• 1.6 去垢剂的种类、功能及作用机制18-19
• 1.7 最新研究变革及研究方向19
• 1.8 本文主要研究内容19-21
• 第2章 实验材料、试剂与方法21-29
• 2.1 实验材料21
• 2.1.1 真核表达系统21
• 2.1.2 原核表达系统21
• 2.2 实验试剂21-22
• 2.3 实验原理及方法22-29
• 2.3.1 分子克隆22-24
• 2.3.2 细胞培养24-25
• 2.3.3 转染25
• 2.3.4 蛋白表达25-26
• 2.3.5 蛋白纯化26-28
• 2.3.6 Western Blotting28
• 2.3.7 Adiponectin与Adip R1 的相互作用检测28-29
• 第3章 脂联素蛋白的表达及纯化29-36
• 3.1 引言29
• 3.2 脂联素蛋白的表达检测29-30
• 3.2.1 脂联素在原核表达系统中的表达检测29
• 3.2.2 脂联素在真核表达系统中的表达检测29-30
• 3.3 脂联素蛋白的纯化30-35
• 3.3.1 原核表达系统中脂联素蛋白的纯化30-32
• 3.3.2 真核表达系统中脂联素蛋白的纯化32-35
• 3.4 讨论35
• 3.5 本章小结35-36
• 第4章 Adip R1的表达纯化及蛋白相互作用研究36-47
• 4.1 引言36
• 4.2 Adip R1 的表达及纯化36-43
• 4.2.1 Adip R1 的表达检测36-38
• 4.2.2 Adip R1 最优表达条件的筛选38-39
• 4.2.3 Adip R1 最优纯化条件的筛选39-42
• 4.2.4 其余两种脂联素受体截短体蛋白的表达42-43
• 4.3 Adiponectin与Adip R1 相互作用的研究43-45
• 4.3.1 分子筛层析研究两种蛋白的相互作用43-44
• 4.3.2 Pull-down实验研究两种蛋白的相互作用44-45
• 4.4 讨论45-46
• 4.5 本章小结46-47
• 结论47-48
• 参考文献48-58
• 致谢58

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