盲肠造疝原位接种瘤块建立小鼠大肠癌肝转移模型方法的改进及评价

发布时间：2017-03-16 01:04

  本文关键词：盲肠造疝原位接种瘤块建立小鼠大肠癌肝转移模型方法的改进及评价，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本课题目的在于改良小鼠盲肠造疝原位接种瘤块模型以提高肝转移率,通过构建该模型初步验证“大肠癌隐性肝转移”的假说,为进一步探索大肠癌肝转移的机制提供基础。本课题首先通过Transwell小室从普通CT26大肠癌细胞中筛选出具有高迁移力的细胞,并通过传代培养,扩增高迁移力的大肠癌细胞,将其用于构建小鼠盲肠造疝原位接种瘤块模型,以提高该模型的肝转移率;接着通过将普通型、低迁移力型、高迁移力型CT26细胞用于构建模型,比较各组模型中的肝转移率以验证高迁移力型CT26大肠癌细胞是否能够提高模型的肝转移率,通过免疫组化方法验证其准确性,并扩大实验样本量验证模型的稳定性;观测小鼠盲肠造疝原位接种瘤块模型的生长特点,筛选出大肠癌隐性肝转移模型,通过病理学确认,应用双向差异凝胶电泳方法对比其与显性肝转移和正常对照组间的差异蛋白质,初步验证“大肠癌隐性肝转移”的理论。方法:实验一:高迁移力CT26大肠癌细胞的培养与筛选选取CT26大肠癌细胞,在含10%小牛血清DMEM完全培养液中常规培养,待细胞数足够时,进行消化取出,在离心管中调整浓度,将一定量细胞加入至普通6孔板中,同时加入适量DMEM完全培养液(这类细胞标记为A组);将等量数目细胞移入Transwell上室中并加入适量高糖DMEM培养液,下室中加入适量DMEM完全培养液(标记为B组);每12小时动态观察Transwell上室及下室细胞生长情况及细胞形态,并与A组细胞相对比,约72小时后将上室中细胞通过消化移出至普通培养皿中(标记为B上组)进行正常培养,下室中细胞继续正常培养(标记为B下组)。实验二:改良模型的构建及其稳定性的验证将A组、B上组、B下组CT26大肠癌细胞从培养皿中消化出来,用1×PBS重悬细胞,分别用注射器在3只SPF级,4-5周,雄性BABL/c小鼠的项背部进行接种,分别标号A、B上、B下,经13天正常饮食后,每只小鼠项背部长出大小约1.5×1.5cm的瘤块,取出项背部瘤块剪碎成2mm大小的小瘤块,标号为A组、B上组、B下组各6只同类小鼠,分别接种相应编号的小瘤块,利用盲肠造疝原位接种瘤块法建立大肠癌肝转移动物模型。建模后小鼠正常饮食,动态观察瘤块生长情况、小鼠体重,于5周后统一处死,观察肝脏大体标本情况,观测表面是否有结节,并将标本做成蜡块,行薄层切片病理检查,确定该结节是否为显性肝转移,将各组之间显性肝转移情况进行对比,验证B下组CT26大肠癌细胞是否具有高迁移力;比较各组之间肝脏转移瘤及原位瘤中S100A8、MMP2、Vimentin等蛋白的表达情况。利用B下组细胞重新对36只小鼠进行模型构建,标记为C组,比较C组与B下组小鼠之间的肝转移率,验证改良模型的稳定性。实验三:大肠癌隐性肝转移假说的验证利用B下组CT26大肠癌细胞,根据实验二步骤构建改良盲肠造疝原位接种瘤块法建立大肠癌肝转移动物模型,于接种瘤块后第5周统一处死小鼠,若其肝脏表面存在结节并在病理下确认是大肠癌肝转移瘤块归类为大肠癌显性肝转移(Colorectal dominant liver metastases,CD)组,肝脏表面无结节并在病理下出现微转移灶归类为大肠癌隐性肝转移(Colorectal recessive liver metastases,CR)组,10只同类小鼠单纯进行同样手术操作而不接种瘤块,归类为非大肠癌(non-Colorectal,NC)组。在实验三中CR组、CD组、NC组小鼠随机抽取7个新鲜肝脏标本进行相应预处理后,行双向差异凝胶电泳方法检查,分离各组小鼠肝脏内蛋白质,并统计分析差异蛋白,验证大肠癌隐性肝转移理论。结果:实验一:高迁移力CT26大肠癌细胞的培养与筛选12小时后下室中没有出现迁移细胞(B下组),24小时后出现的迁移细胞与A组细胞、B上组细胞对比发现:前者细胞形态较圆,突触较少、较短,呈星形的细胞相对较少。72小时后,迁移细胞数目增多,细胞贴壁生长后突触延伸,与A组细胞相比,细胞突触数目相对较少,但细胞突触较A组细胞较长。实验二:改良模型的构建及其稳定性的验证建模后小鼠术后恢复良好,创口无出现感染、瘘道,B上组⑤小鼠不成瘤,整体成瘤率为94.4%,B下组小鼠体重较其余2组低,与B上组小鼠相比差异性较大(P0.05),B下组瘤块体积显著大于其余2组(P0.05)。5周后小鼠统一处死,A组、B上组小鼠肝脏大体标本无肝转移灶,B下组小鼠中2只小鼠肝脏见可疑转移灶,病理结果提示前2组小鼠肝脏只出现微小转移灶,B下组小鼠中2只小鼠肝脏转移灶明确为大肠癌肝转移;B下组小鼠原位瘤组织中S100A8蛋白表达水平显著高于其余2组(P0.05),B下组小鼠肝转移灶组织中S100A8蛋白表达水平高于原位瘤组织,但无统计学意义;B下组小鼠原位瘤组织中MMP-2蛋白表达水平高于其余2组(P0.05),而B下组显著高于B上组(P0.05),小鼠肝转移灶组织与原位瘤组织中MMP-2蛋白表达差异无统计学意义;B下组小鼠原位瘤组织中Vimentin蛋白表达水平显著高于其余2组(P0.05),B下组小鼠肝转移灶组织中Vimentin蛋白表达水平高于原位瘤组织(P0.05)。通过扩大模型的数量,肝转移率为27.7%,与前期造模时肝转移率比较无统计学差异(P0.05),提示改良模型存在较好的稳定性。实验三:大肠癌隐性肝转移假说的验证CD组中有7只小鼠肝脏大体标本可观察转移灶及病理下确认为大肠癌肝转移,肝脏病理出现微小转移灶则纳入CR组,肝转移率为25%,接近于B下组小鼠的肝转移率。通过双向差异凝胶电泳电泳分离3组小鼠肝脏蛋白质,利用DecyderTM2D6.5软件分析CD组与NC组存在的差异蛋白位点数平均为107个,CR组与NC组存在67个蛋白差异位点,CR组与CD组存在差异蛋白位点数平均为23个,初步论证“大肠癌隐性肝转移”的理论假说。结论:1.通过Transwell小室从体外分离培养,分离出具有较高的迁移力的CT26大肠癌细胞。2.利用具有较高迁移力的CT26大肠细胞进行盲肠造疝原位接种瘤块模型构建,提高模型的肝转移率,并且具有较好的稳定性。3.根据盲肠造疝原位接种大肠癌模型,模拟隐性肝转移现象,并通过病理学和蛋白质组学方法,初步论证“大肠癌隐性肝转移”理论的可行性。
【关键词】：大肠癌肝转移 CT26细胞 小鼠模型 Transwell 免疫组化 双向蛋白凝胶电泳
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34;R-332
【目录】：

• 中英文缩略词对照表3-7
• 摘要7-11
• Abstract11-16
• 前言16-20
• 主要材料与方法20-46
• 实验一 高迁移力CT26 大肠癌细胞的培养与筛选20-27
• 1 试验材料20-23
• 1.1 细胞系20
• 1.2 主要试剂20
• 1.3 试剂配制20-22
• 1.4 主要仪器22-23
• 2 实验方法23-27
• 2.1 复苏细胞23
• 2.2 细胞换液23-24
• 2.3 细胞传代24
• 2.4 Transwell 迁移实验24-25
• 2.5 细胞冻存25-27
• 实验二 改良模型的构建及其稳定性的验证27-34
• 1 试验材料27-29
• 2 试验方法29-34
• 2.1 细胞悬液制备29-30
• 2.2 大肠癌模型的建立30-31
• 2.3 实验相关指标观察、样本采集、处理31-34
• 实验三 大肠癌隐性肝转移假说的验证34-45
• 1 试验材料34-37
• 2 试验方法37-45
• 2.1 细胞悬液制备37
• 2.2 大肠癌模型的建立37
• 2.3 实验相关指标观察、样本采集、处理37-45
• 附 技术线路图45-46
• 结果46-68
• 实验一46-49
• 细胞形态变化46-49
• 实验二49-59
• 1 小鼠一般特征49-51
• 2 小鼠肝脏大体标本51-52
• 3 肝脏组织病理学变化52
• 4 各组大肠癌显性肝转移率比较52-53
• 5 S100A8、MMP-2、Vimentin等蛋白免疫组化检测结果53-58
• 6 改良模型稳定性的验证58-59
• 实验三59-68
• 1 小鼠一般特征59
• 2 小鼠肝脏大体标本59-60
• 3 肝脏组织病理学变化60-61
• 4 再次分组及各组小鼠体重、瘤块体积的比较61-64
• 5 实验三中CR组、CD组、NC组小鼠肝脏中差异蛋白比较64-68
• 讨论68-74
• 附图74-75
• 参考文献75-81
• 致谢81-82
• 文献综述82-90
• 参考文献88-90

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 张凌志,邸菁,王运杰,赵昕,张朝东;Transwell小室筛选高侵袭性C6细胞MMP-2和TIMP-2的表达[J];肿瘤防治杂志;2005年10期

2 黄宝玉;赵任;秦婧;贾晓斌;朱建伟;;靶向干预N-W ASP功能区对大肠癌细胞侵袭转移能力的影响[J];世界华人消化杂志;2009年21期

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本文编号：251185