沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过上调DJ-1蛋白表达激活ERK信号通路抑制细胞凋亡

发布时间：2017-03-16 04:04

  本文关键词：沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过上调DJ-1蛋白表达激活ERK信号通路抑制细胞凋亡，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)能通过抑制宿主细胞凋亡以逃避宿主的免疫清除,但其抗凋亡机制并未完全阐明。本研究试图探讨Ct质粒蛋白pORF5与ERK1/2信号转导通路和互作宿主蛋白DJ-1三者之间的关系以及对细胞凋亡的影响,为阐明Ct致病机制提供实验依据。方法:用肿瘤坏死因子(TNF-α,20ng/ml)和放线菌酮(CHX,2μg/ml)诱导pORF5基因稳定转染的HeLa细胞(pORF5-HeLa)和空质粒稳定转染的对照HeLa细胞(GFP-HeLa)凋亡6h,利用Hoechst33342染色检测两组细胞凋亡情况,实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot分别检测凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平;用ERK1/2特异性抑制剂PD98059(30μM/ml)预处理pORF5-HeLa细胞30min后,再用凋亡诱导剂(TNF-α/CHX)刺激ERK抑制剂处理组pORF5-HeLa细胞(PD98059/pORF5-HeLa)和未加抑制剂组pORF5-HeLa细胞6h,利用Hoechst33342,TUNEL染色和流式细胞仪检测两组细胞凋亡率,采用qRT-PCR和Western blot分别检测Bax、Caspase-3、Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平;将sh-RNA-DJ-1病毒液感染pORF5-He La细胞,建立稳定干扰DJ-1表达的pORF5-HeLa细胞系及空白载体转染的对照细胞系;凋亡处理6h后,利用Hoechst33342,TUNEL染色和流式细胞仪检测稳定干扰DJ-1的pORF5细胞以及对照组细胞的凋亡率,qRT-PCR,Western blot检测Bax、Caspase-3和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平;用凋亡诱导剂(TNF-α/CHX)刺激经PD98059预处理的pORF5-HeLa细胞和未处理组细胞6h,Western blot检测两组细胞的DJ-1蛋白表达;用凋亡诱导剂(TNF-α/CHX)刺激稳定干扰DJ-1表达的pORF5-HeLa细胞和对照细胞6h,Western blot检测两组细胞的ERK1/2磷酸化水平。结果:1、hoechst染色结果显示,对照组gfp-hela细胞出现较多固缩,碎裂,亮蓝浓染核,而porf5-hela细胞核染色呈均匀,弥散荧光,porf5-hela细胞的凋亡率较对照组下降32.4%(p0.05);porf5-hela细胞中bax和caspase-3的mrna水平较对照组分别下降5.6倍(p0.01)和18.6倍(p0.01);porf5-hela细胞中bax的蛋白水平较对照组下降78.2%(p0.01),而bcl-2较对照上升167.8%(p0.01)。2、hoechst和tunel染色结果显示,erk抑制剂处理组porf5-hela细胞的凋亡率较未处理组升高了28.5%(p0.05),erk抑制剂处理组tunel阳性细胞百分率为(54.6±2.1)%,未处理组阳性细胞百分率为(12.5±3.4)%,erk抑制剂处理组的tunel阳性细胞百分率较未处理组升高了42.1%(p0.05);流式细胞仪检测结果显示,erk抑制剂处理组的porf5-hela细胞的凋亡率较未处理组增加12.57%;erk抑制剂处理组的porf5-hela中bax和caspase-3的mrna水平分别较未处理组升高2.5倍(p0.01)和302.7倍(p0.01);wb结果显示,erk抑制剂处理组的porf5-hela中bax蛋白水平较未处理组升高264.3%(p0.01),bcl-2蛋白水平较未处理组降低86.6%(p0.01)。3、hoechst和tunel染色结果显示,shdj-1-porf5-hela细胞凋亡率较对照组增加30.8%(p0.05),shdj-1-porf5-hela细胞中tunel阳性细胞百分率为(45.2±2.3)%,未干扰组仅为(8.3±2.0)%,dj-1稳定干扰组的tunel阳性细胞百分率较对照组升高了36.9%(p0.05);流式细胞仪检测结果显示:shdj-1-porf5-hela细胞的凋亡率较对照组上升了17.05%;shdj-1-porf5-hela细胞中bax和caspase-3的mrna水平分别是对照组的187.8倍(p0.01)和3.6倍(p0.01);shdj-1-porf5-hela细胞中bax的蛋白水平较对照组升高387.5%(p0.01),bcl-2蛋白水平较对照组下降91.0%(p0.01)。4、erk抑制剂处理组的porf5-hela细胞中的dj-1蛋白表达水平与未处理组无差别(p0.05);shdj-1-porf5-hela细胞中的erk1/2磷酸化水平较对照组下降了102.8%(p0.05)。结论:1、沙眼衣原体pORF5质粒蛋白具有抵抗细胞凋亡作用。2、pORF5质粒蛋白通过上调宿主蛋白DJ-1的表达激活ERK1/2信号通路抑制细胞凋亡。
【关键词】：沙眼衣原体 pORF5质粒蛋白 细胞凋亡 DJ-1 ERK1/2
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R374
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 第1章 绪论11-13
• 第2章 实验材料13-15
• 2.1 主要实验仪器13
• 2.2 载体及细胞株13
• 2.3 主要试剂盒13-14
• 2.4 主要实验试剂14
• 2.5 其他14-15
• 第3章 实验方法15-25
• 3.1 pORF5质粒蛋白与细胞凋亡的关系15-20
• 3.2 ERK活性对p ORF5-He La稳转株凋亡的影响20-22
• 3.3 DJ-1 蛋白的表达对p ORF5稳转株凋亡的影响22-23
• 3.4 pORF5-He La细胞中ERK活性与DJ-1 蛋白表达的关系23-24
• 3.5 统计学分析24-25
• 第4章 实验结果25-41
• 4.1 pORF5质粒蛋白与细胞凋亡的关系25-28
• 4.2 抑制ERK1/2 的激活对pORF5-HeLa细胞凋亡的影响28-32
• 4.3 干扰DJ-1 蛋白的表达对pORF5-HeLa细胞凋亡的影响32-38
• 4.4 pORF5-He La细胞中ERK的激活与DJ-1 宿主蛋白表达升高的上下游关系38-41
• 第5章 讨论41-45
• 第6章 结论45-47
• 参考文献47-51
• 综述 γ 干扰素与自噬在抗沙眼衣原体感染中的作用51-59
• 参考文献55-59
• 作者攻读学位期间的科研成果59-61
• 致谢61

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