人肠道菌群体外模型及潜在应用研究

发布时间：2017-03-16 10:03

  本文关键词：人肠道菌群体外模型及潜在应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：建立人肠道菌群体外静置培养模型和连续发酵模型,研究其潜在的应用价值。方法：①建立人肠道菌群体外静置培养模型,将自动酿酒综合症病人1例和健康志愿者2例的粪便分别接种于碳源为葡萄糖、淀粉、糊精和没有碳源的VI培养基中发酵培养,利用气相色谱检测8h、16h、24h和48h时培养基内酒精浓度。将病人粪便分别接种于含有利福昔明、甲硝唑、左氧氟沙星、亚胺培南的抗生素培养基发酵培养,用高效液相色谱检测VFA含量,沉淀进行细菌DNA提取和16SrRNA基因高通量测序。②建立人肠道菌群体外连续发酵模型,取6个正常人(TXZ、FB、SQS、LW、WYS、CXX)的粪便样品,利用以淀粉为碳源的培养基(VI)和以淀粉+多糖为碳源的培养基(XP)连续培养,7d后取样,上清检测SCFA,沉淀用于细菌DNA提取和PCR-DGGE.粪便样品和发酵第13天样品的DNA做高通量测序。同样方法,用单糖培养基(MD-1、MD-2)和改良VI培养基(VI-1、VI-2、VL)对LW进行模拟发酵。③建立溃疡性结肠炎小鼠模型,将C57BL/6小鼠随机分为6组,A组是空白组,B组是模型组,CDEF组是实验组。A组给予无菌水,BCDEF组给予2%DSS自由饮用6天造模。第7、9、11天,A组和B组给予PBS灌胃,C组给予1%TXZ原始粪菌液,D组给予1%WYS原始粪菌液,E组给予TXZ冻干发酵产物,F组给予WYS冻干发酵产物灌胃(0.1 m1/10 g体重)。每天记录小鼠存活数量和生存状态至第13天。站果：①通过静止模型研究证明自动酿酒综合征病人粪便菌群体外发酵产生高浓度的酒精,和正常人粪便菌群相比较,病人粪便接种在葡萄糖培养基中产生高含量的酒精(P0.05)。同时病人粪便菌群在葡萄糖中产生的酒精含量比在淀粉、糊精的培养基中高(P0.05)。用含有利福昔明、甲硝唑、左氧氟沙星的培养基培养病人肠道菌群仍可以产生酒精,但在亚胺培南培养基中酒精产量几乎为零。16s rRNA测序证明在含有亚胺培南培养基发酵后Escherichia-Shigella、Parasutterella、Veillonella数量明显减少,显示这些细菌可能参与了体内酒精的产生。②在体外连续发酵系统模拟人肠道菌群研究中共完成6个人的肠道菌群体外模拟试验,比较了两种发酵培养基VI和XP体外模拟效果。发酵罐平衡8天后DGGE图条带数目和亮度保持恒定,发酵罐开始进入平衡状态。通过16s rRNA测序比较原始接种粪便样品的菌群结构和发酵产物的菌群结构,发现所有样品含有80～160个OTU,发酵样品OTU数量均少于相对应的粪便样品。同一个人的粪便样品在XP培养基内的OTU数量比VI多。而6个试验对象的肠道菌群结构显示两种已经报告过的肠型,即TXZ、FB、SQS的粪便样品中拟杆菌属含量高,属于拟杆菌肠型；而LW、WYS、CXX粪便样品则以普雷沃氏菌属为主,属于普雷沃菌肠型。在粪便样品中主要有拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门,而发酵样品为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门。在门的水平上,发酵样品与粪便样品种类相似。在不考虑丰度时,VI和XP对6个人粪便细菌的模拟相似性均为50%左右,其中VI培养基对TXZ、SQS的模拟效果较好,而XP培养基对FB、LW、CXX的模拟效果较好。在考虑丰度时,VI和XP培养基对拟杆菌肠型的粪便样品的模拟效果在80%-90%,而对普雷沃菌肠型的模拟相似性在25%以下。测定了发酵罐内产生10-30 mmol/L SCFA,最多的是丁酸和丙酸。③本研究的最后部分评估了不同肠型的粪便接种物和发酵产物对小鼠溃疡性结肠炎(DSS)模型中炎症的影响。和A组相比,B组小鼠第6天垫料和肛门口出现血渍,疾病活动指数(DAI)升高。结肠HE染色切片模型组粘膜结构破坏,多发浅溃疡和炎性细胞浸润,显示造模成功。接种两种肠型的粪便菌群后,小鼠(C组拟杆菌肠型；D组普雷沃菌肠型)大量死亡。而接种相对应的发酵物(E组和F组)小鼠死亡数量与模型组相同。结论：本实验建立的体外静置培养模型可用于快速、短时、批量检测肠道病原菌。建立的体外连续发酵模型对拟杆菌为主的肠道菌群模拟效果达80%以上,对普雷沃氏菌为主的肠道菌群模拟效果在25%以下,模型效果较低。人粪便制品和发酵产物移植小鼠UC模型不成功,需要进一步实验研究。
【关键词】：肠道菌群 体外模型 模拟发酵 溃疡性结肠炎
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R333.3
【目录】：

• 英文缩略词表6-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 第一章 人肠道菌群体外静置培养模型的研究和应用14-25
• 1.1 实验设计14
• 1.2 实验材料14-16
• 1.3 实验方法16-20
• 1.4 结果20-23
• 1.5 讨论23-25
• 第二章 人肠道菌群体外连续发酵模型的建立和评估25-45
• 2.1 实验设计25
• 2.2 实验材料25-26
• 2.3 实验方法26-31
• 2.4 结果31-40
• 2.5 针对普雷沃氏菌肠型的模拟研究40-43
• 2.6 讨论43-45
• 第三章 发酵产物对溃疡性结肠炎模型小鼠的初步运用45-51
• 3.1 实验设计45
• 3.2 实验材料45-46
• 3.3 实验方法46-47
• 3.4 结果47-49
• 3.5 讨论49-51
• 第四章 结论51-52
• 参考文献52-55
• 文献综述55-67
• 参考文献61-67
• 附录67-69
• 攻读学位期间发表文章情况69-70
• 致谢70

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本文编号：251599