IGF-1对肌萎缩侧索硬化细胞稳转模型的保护作用

发布时间：2017-03-16 10:06

  本文关键词：IGF-1对肌萎缩侧索硬化细胞稳转模型的保护作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种进行性、致死性的神经系统变性性疾病,主要侵犯脑和脊髓的上、下运动神经元,最终导致瘫痪和死亡。然而其确切的发病机制目前仍不清楚并且尚无行之有效的治疗手段。最近,在ALS和含有泛素阳性包涵体的额颞叶痴呆患者的运动神经元及胶质细胞中均发现了异常泛素化的蛋白聚集体,主要成分是43KD的TAR DNA结合蛋白(TDP43),它由TARDBP基因编码。正常情况下TDP-43主要分布于细胞核,参与剪切和转录调控。TDP43由414个氨基酸组成,包括两个RNA识别区域和一个富含甘氨酸的羧基末端区域。最近研究表明TARDBP突变是ALS较为常见的一种基因突变,并且几乎所有与ALS相关的TDP43突变都源于其羧基末端的甘氨酸富含区域。然而目前我们仍不清楚,突变的TDP-43是通过毒性功能的获得还是正常功能的丢失来介导神经元退行性变的。突变的TDP43可以被截断,产生一个25KD的羧基末端片段:TDP25,它更容易错误折叠和聚集,在ALS的病理过程中发挥着重要作用。据文献报道,稳定表达TDP25能够诱导细胞产生显著的氧化应激及凋亡,具有细胞毒性作用。运动神经元正常的生理功能依赖于神经生长因子持续、严格的调控,在运动神经元不同的发育阶段,神经生长因子参与神经元增殖、轴突生长、突触形成等重要生理过程。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一种神经生长因子,属于胰岛素家族。由于它在生长及代谢方面的作用,IGF-1已经用于生长因子缺乏和糖尿病等疾病的治疗。目前,越来越多的人开始关注它对神经变性性疾病的治疗作用。最近研究表明IGF-1对中枢及外周神经系统都具有神经保护作用。IGF-1可以激活PI3K/Akt和P44/42 MAPK信号通路,产生一系列的细胞保护效应,包括:细胞增殖、分化、抑制凋亡。另外,JPK、P38 MAPK和m TOR信号通路也与IGF-1相关。然而IGF-1信号系统十分复杂,受IGF-1受体(IGF-1R)及IGF-1结合蛋白(IGFBPs)等多种因子的调控。对IGF-1系统的深入研究有可能为ALS治疗提供一个新的靶点。目的:研究IGF-1对稳定表达TDP25蛋白的NSC34细胞的保护作用。方法:本研究采用TDP25稳转的NSC34细胞作为肌萎缩侧索硬化的细胞模型。用不同浓度(0ng/ml,0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1000ng/ml)IGF-1干预稳转的NSC34细胞24小时,显微镜下观察不同浓度IGF-1干预后细胞形态变化,并通过CCK-8试剂盒检测不同浓度IGF-1对细胞活力的影响,确定IGF-1最适药物浓度;采用适当浓度的IGF-1干预细胞24小时后,通过LDH及MDA试剂盒检测IGF-1是否能减少TDP25产生的细胞毒性;采用适当浓度的IGF-1干预细胞24小时后,通过Western免疫印记法检测IGF-1对caspase3(凋亡标记蛋白)和HO-1(抗氧化蛋白)表达的影响。结果:(1)通过免疫印迹法检测到稳转TDP25质粒的NSC34细胞中有外源性TDP25蛋白的表达,成功建立ALS细胞稳转模型。(2)不同浓度(0-1000ng/ml)IGF-1干预稳转NSC34细胞后,镜下观察发现100ng/ml IGF-1能显著促进细胞轴突生长,维持细胞良好形态;CCK-8检测发现除0.1ng/ml IGF-1外,其他不同浓度IGF-1给药组均能提高细胞活力,并且10ng/ml及100ng/ml的IGF-1效果更好,所以最终我们选择10ng/ml和100ng/ml作为IGF-1的最适浓度。依次用0ng/ml、10ng/ml(低剂量)、100ng/ml(高剂量)IGF-1干预稳转NSC34细胞24小时后,分别检测不同IGF-1浓度下细胞毒性LDH及MDA水平变化,结果显示与对照组比,给药组两个浓度下的IGF-1均能显著降低LDH及MDA水平,且两个给药剂量组之间无明显统计学差异。(3)依次用0ng/ml、10ng/ml(低剂量)、100ng/ml(高剂量)IGF-1干预稳转NSC34细胞24小时后,通过western印迹检测caspase3、HO-1蛋白表达水平变化,结果显示,与对照组相比,给药组两个浓度下的IGF-1均能抑制caspase3表达水平,并上调HO-1表达水平,而且高剂量组作用效果优于低剂量组。结论:在稳定表达TDP25蛋白的ALS细胞模型中,IGF-1能够降低TDP25产生的细胞毒性,抑制凋亡和氧化应激,且高剂量的IGF-1能够促进细胞轴突生长,具有明显的细胞保护作用。
【关键词】：IGF-1 肌萎缩侧索硬化 TDP25 caspase3 HO-1
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R744.8;R-332
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文缩写10-11
• 前言11
• 材料与方法11-21
• 结果21-23
• 附图23-29
• 讨论29-31
• 结论31
• 参考文献31-35
• 综述 胰岛素样生长因子1对肌萎缩侧索硬化的研究进展35-46
• 参考文献41-46
• 致谢46-47
• 个人简历47

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本文编号：251618