Gohesin在Ⅰ型单纯疱疹病毒裂解感染中作用机制的研究

发布时间：2017-03-16 10:07

  本文关键词：Gohesin在Ⅰ型单纯疱疹病毒裂解感染中作用机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：I型单纯疱疹病毒是一种线性双链DNA病毒,属于α疱疹病毒亚型。其基因组全长152kb,编码80个左右的蛋白,是所有病毒中研究最多、最深入的病毒之一。HSV-1可感染上皮细胞并大量复制,通过感觉神经节进入神经元而进行潜伏,其DNA环化并整合到宿主染色体中从而重组宿主细胞的细胞核。HSV-1经UV照射皮肤,发烧发热,心理压力,机体受创伤,重金属毒性刺激后会重激活从而进入裂解感染期,进入裂解期的病毒DNA可以利用宿主细胞的核苷酸、组蛋白和转录复制所需的复合体依次合成病毒的即早期蛋白、早期蛋白和晚期蛋白,HSV-1感染多引起口腔疱疹,部分会导致病毒性角膜炎和生殖疱疹,造成严重的社会和公共卫生问题。因此加强对单纯疱疹病毒感染机制的研究对眼科疾病和性病等传染性疾病的预防治疗和控制具有重要意义。Cohesin是一种由SMC1、SMC3和两个kleisin家族蛋白SCC1(Mcd1/Rad21)、 SCC3(SA1/SA2)这四种蛋白组成的蛋白复合体。在cohesin复合体中,SMC1蛋白和SMC3蛋白首先都以反向螺旋的二级结构相结合,形成一种V型的异二聚体,每个蛋白的氨基端与羧基端相结合构成的二聚体"head"结构域具有ATP酶活性,随后SMC1和SMC3发挥ATP酶活性水解ATP,使Rad21蛋白桥连SMC1和SMC3的"head"结构域并与SCC3结合,形成cohesin环状结构复合体。环状复合体的内部直径大约在40nm左右,足以包围住两条DNA分子,Cohesin通过其亚基蛋白的磷酸化、乙酰化、ATP水解等修饰调控其与染色体的结合和释放,早期研究发现该复合体的一个主要功能是作为分裂间期染色质和分裂期染色体的重要成分,调节姐妹染色单体的结合与分离,参与细胞周期调控,并由此而命名。其对DNA损伤修复和转录、复制调控也起着重要的作用。Cohesin功能上的微小破坏都会对人类生长和发育造成巨大的影响。研究发现cohesin作为一种拓扑装置,参与染色体结构和染色体远程相互作用的调控,如loop结构的形成、启动子的选择等。在许多病毒如KSHV、EBV、HPV等感染宿主细胞过程中,cohesin也起着重要的调节作用,并且在不同的病毒感染过程中,Cohesin的调控机制不尽相同。HSV-1复制中心需要宿主染色质结构调控相关的cohesin复合体的参与,其作用机制是我们研究的重点。我们通过研究cohesin复合体中的两种核心亚基蛋白SMC1和Rad21对HSV-1裂解感染的影响,观察到cohesin可以被HSV-1的复制中心招募。分别敲低宿主细胞的SMC1和Rad21都能抑制病毒复制中心的形成。在cohesin敲低细胞中HSV-1的感染率下降,且病毒复制区从弥散到形成明显foci的成熟过程相较于对照细胞也明显降慢,这些都表明cohesin对病毒复制中心的形成起着促进作用。Cohesin对HSV-1裂解基因的转录也有着重要的影响,在SMC1和Rad21敲低细胞中,病毒裂解基因转录的mRNA产物发生降低,敲低cohesin也推迟了其即早期蛋白和晚期蛋白的合成,表明cohesin有利于病毒裂解基因的表达。另外用qPCR观察敲低cohesin对病毒拷贝数的影响发现,Cohesin对HSV-1基因组DNA的复制也起着促进的作用。ChIP-qPCR研究cohesin敲低前后,RNA PolⅡ和RNA Pol Ⅱ(CTD)ser5p在病毒基因组上结合的变化,发现敲低cohesin后病毒基因组上RNA pol Ⅱ的结合降低而RNA Pol Ⅱ(CTD) ser5p的结合增加,推断cohesin可以通过与RNA Pol Ⅱ的有效转录调控病毒基因的表达。另外研究发现敲低cohesin可以提高抑制性组蛋白H3K27me3在病毒基因组上的结合,说明cohesin可以通过调节病毒染色体状态来调控其与宿主细胞的相互作用。
【关键词】：Ⅰ型单纯疱疹病毒 Cohesin复合体 复制中心 转录 敲低
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 缩略词10-11
• 第一章 绪论11-28
• 1. HSV-111-22
• 1.1 疱疹病毒的分类和危害11-12
• 1.2 HSV-1的结构及其基因组12-14
• 1.3 HSV-1的感染过程及潜伏14-17
• 1.4 细胞抵抗HSV-1的方式17-18
• 1.5 HSV-1在潜伏期感染中的免疫系统反应18-19
• 1.6 HSV-1潜伏期感染的表观遗传调控19-20
• 1.7 HSV-1裂解感染过程中的表观遗传学调控20-22
• 2. COHESIN简介22-28
• 2.1 Cohesin的结构22-23
• 2.2 Cohesin与细胞周期调控23-24
• 2.3 Cohesin与DNA损伤修复24-25
• 2.4 Cohesin与基因表达调控25-26
• 2.5 Cohesin与病毒和宿主间相互作用26-28
• 第二章 材料与方法28-40
• 1. 实验材料28-32
• 1.1 细胞、病毒和菌株28
• 1.2 试剂28
• 1.3 溶液28-32
• 4. 实验方法32-40
• 4.1 细胞培养32
• 4.2 慢病毒敲低32-33
• 4.3 siRNA敲低33
• 4.4 免疫荧光染色33-34
• 4.5 Western Blot34-35
• 4.6 病毒基因组转录的检测35-37
• 4.7 病毒DNA复制的检测37
• 4.8 ChIP37-40
• 第三章 实验结果40-49
• 1. COHESIN能够被HSV-1病毒复制区招募40-41
• 2. 敲低COHESIN与HSV-1病毒复制中心的形成41-43
• 3. COHESIN与HSV-1病毒裂解基因蛋白的表达43-44
• 4. COHES1N对HSV-1病毒转录的影响44-45
• 5. COHESIN对HSV-1病毒复制的影响45-46
• 6. COHESIN对RNA POL Ⅱ在HSV-1基因组上结合的影响46-48
• 7. COHESIN对组蛋白H3K27ME3在HSV-1基因组上结合的影响48-49
• 第四章 总结与讨论49-51
• 参考文献51-57
• 致谢57

【参考文献】

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1 洪涛,楚雍烈,周静仪,姜惠英;单纯疱疹病毒形态发生方式的研究Ⅰ.细胞质内形态发生方式的电镜观察[J];中国医学科学院学报;1981年S1期

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本文编号：251623