SNX10，SNX11蛋白功能研究

发布时间：2019-07-20 18:31

【摘要】：内涵体转运是真核调节蛋白质功能的一个重要手段。蛋白需要通过内涵体转运在适当的时间定位到适当的区域以发挥它正常的生理功能。同时内涵体转运也可以通过修饰和降解等方法调节蛋白的活性。Sorting Nexins(SNXs)是一个新的与内涵体分选相关蛋白家族。它们以PX结构域为特征结构。PX结构域是个磷酸肌醇结合结构域,SNXs通过PX与磷酸肌醇的结合定位到内涵体膜上。由于SNXs在除PX结构域外的蛋白结构上较大的差异,这些成员在多样的内涵体转运通路上发挥功能。 SNX10,SNX11是SNXs家族结构最简单的一类蛋白,除了PX结构域外不含有其它已知的功能性结构域。这两个蛋白在氨基酸序列具有很高的相似性,在进化上也最为接近。但它们的功能完全未知。我们实验室第一次发现在细胞中高表达SNX10可以诱导出巨大的空泡结构,但对这个过程的分子机制并不清楚。我们发现SNX10主要定位在Rab5阳性的早期内涵体上,而诱导出的空泡则显示出晚期内涵体标记,说明SNX10可能开启了一条通路,加速了由早期内涵体向晚期内涵体的转变。而在这个过程中抑制Rab7可以起到抑制SNX10表型的作用,而Rab5抑制则不产生影响,说明这条通路不依赖于Rab5而依赖于Rab7。同时我们发现SNX11可以特异性的抑制SNX10的表型。SNX11在早期和晚期内涵体上都有部分定位。当SNX11与SNX10一起转染入细胞时,SNX11与SNX10共定位在早期内涵体上,并抑制Rab7标记的晚期内涵体的扩大。进一步的研究发现,V-ATPase参与了SNX10诱导的空泡化。SNX10与V-ATPase的V1D亚基相互作用,由此V-ATPase被异常激活可能是增强的内涵体膜融合和酸化的原因。SNX11也与V1D亚基相互作用。SNX11,SNX10对V1D的结合具有竞争关系,并且SNX11表现出更强的亲和力。V-ATPase的异常活性也是VacA诱导细胞空泡的原因,我们发现SNX11也可以抑制VacA诱导的空泡的形成。以上这些结果说明了SNX10,SNX11通过V-ATPase调节内涵体。我们进一步在斑马鱼中研究SNX10的生理功能。用morpholino的方法敲降SNX10后,可以破坏斑马鱼的左右不对称发育。KV(Kupffer’s Vesicle)是决定斑马鱼作用不对称发育的重要器官,而KV中纤毛在其发挥功能的关键。我们发现在注射SNX10 morpholino的胚胎中,KV的纤毛形成受到抑制。体外实验的结果表明SNX10调节细胞的纤毛发生。SNX10定位在纤毛基体的周围。负责高尔基体与基体之间膜泡运输的Rab11与SNX10表现出部分功定位。与纤毛膜泡转运相关的蛋白BBS4,IFT88也表现出与SNX10的共定位。而用siRNA敲降SNX10可以阻碍细胞中的纤毛形成。因为SNX10/V-ATPase一起调节内涵体形态,所以V-ATPase也可能参与对纤毛膜泡运输的调控。用V1D和Vod1的GFP融合蛋白我们发现V-ATPase定位在基体上,与纤毛运输相关的蛋白表现出共定位。在细胞中敲降V-ATPase可以抑制纤毛的形成,而在斑马鱼中敲降V-ATPase则在KV,原肾管,侧线等多个器官中造成纤毛缺陷。而且在体内和体外实验中,SNX10和V-ATPase对纤毛的调节都表现出协同作用。这些结果支持SNX10/V-ATPase通过膜泡转运调节纤毛发生的假设。在进一步的研究中,我们发现V-ATPase在中心体上定位依赖于SNX10,在敲降SNX10的细胞中,V-ATPase在中心体上定位的比例明显降低。这说明了在这过程中SNX10对V-ATPase的调节方式。同时我们也发现SNX10,V-ATPase的siRNA可以阻止Rab8向纤毛的转运,这一结果从另一侧面说明在纤毛发生过程中SNX10/V-ATPase对膜泡转运的调节。综上所述,我们发现: 1, SNX10,SNX11调节早期内涵体向晚期内涵体的转变,这个调节是通过V-ATPase来实现的。SNX10和SNX11都与V-ATPase的V1D亚基相互作用, 2, SNX11通过竞争性的与V1D结合来抑制SNX10的功能。 3, SNX10/V-ATPase途径调节纤毛的发生。SNX10调节V-ATPase在中心体的定位。它们都是向纤毛方向的膜泡转运所需要的。
【图文】：
Rabs与内涵体系统（Stenmark，2009）真核细胞具有复杂的内涵体系统，调节细胞中不同结构之间的物质转运

2图 1.1 Rabs 与内涵体系统（Stenmark，2009）真核细胞具有复杂的内涵体系统，调节细胞中不同结构之间的物质转运。Rab small GTPase 是调节这些内涵体转运的一类重要的蛋白。Rab5 调节从细胞质膜的内吞和早期内涵体的成熟。Rab7 调节早期内涵体向晚期内涵体的转变和晚期内涵体-溶酶体的成熟过程。Rab9 调节从晚期内涵体向高尔基 TGN 的运输。Rab11调节循环内涵体将膜泡及其内涵体物质循环到质膜上。Rab8，Rab17，Rab23 调节胞质向纤毛内的膜泡转运。还有很多 Rab 在其他细胞器和膜泡之间的转运中起作用。精细的膜泡结构区分和调节蛋白的分工形成复杂的内涵体系统。1.1.1 早期内涵体 early endosome（EE）细胞需要不停的与外界基质进行物质交换。细胞膜外物质通过多种途径进入细胞的内涵
SortingNexins家族（Cullen，2008）SNXs家族的结构示意图，所有SNX蛋白有PX结构域为特征结构，除此之外不同的SNX含有的结构差别较大，根据拥有结构域的不同把SNX分为三类，第一类SNX都具有Bar结构域，称为Bar-SNX

图 1.2 Sorting Nexins 家族（Cullen，2008） SNXs 家族的结构示意图，所有 SNX 蛋白有PX 结构域为特征结构，除此之外不同的 SNX 含有的结构差别较大，根据拥有结构域的不同把 SNX 分为三类，第一类 SNX 都具有 Bar 结构域，称为 Bar-SNX。第二类只有 PX 结构域，，对这一类目前只有很少的研究。第三类 SNX 具有其他差异较大的结构域。1.2.1 SNX1/SNX2，SNX5/SNX6SNX1 是第一个被发现的 SNX 蛋白，含有一个 PX 结构域和一个 Bar 结构域。SNX1 的PX 结构域以 PI(3,5)P2 为靶点，定位到内涵体膜上，对 EGFR 向晚期内涵体/溶酶体的转运和降解起到重要的调节作用。在这个过程中，SNX1 与 Hr（sHepatocyte growth factor-regulatedtyrosine kinase substrate），EGFR 形成大的复合体并定位在早期内涵体上，调节了 EGFR 从早期内涵体向晚期内涵体的转运(Kurten, Cadena et al. 1996; Chin, Raynor et al. 2001)。SNX1的另一功能是与 SNX2 一起调节向内涵体向 TGN 的 retrograde transport。SNX1 和 SNX2 可以形成同源二聚体或异二聚体，两者在功能上可以相互替换。当 SNX1/SNX2 通过 PX 定位内涵体膜上时，它们将 VPS26/29/35 复合体募集到膜上,形成 retromer 复合体。这个复合体
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【共引文献】