一、B型链球菌毒力因子的初步晶体学研究 二、免疫卡控点TIGIT抗原表位和抗体CDR序列的初步研究

发布时间：2017-03-16 15:04

  本文关键词：一、B型链球菌毒力因子的初步晶体学研究 二、免疫卡控点TIGIT抗原表位和抗体CDR序列的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：1.B型链球菌毒力因子的初步晶体学研究B型链球菌(GBS)是导致围产期和新生儿感染的主要病原菌,主要存在于大约25%健康女性的生殖道中。GBS在子宫内的上行感染增加了新生儿患肺炎,败血症,脑膜炎的风险。目前,国内外对于GBS的预防方案采用的主要是抗生素预防,但是近些年出现的GBS对抗生素的耐受性引起了对GBS感染治疗的关注。目前还没有有效的措施预防GBS的上行感染,因此新型疫苗和抗菌药物的开发已经迫在眉睫,而针对GBS毒力蛋白或其合成途径设计抑制性药物是一种较为有效且可行的方案。GBS基因组测序已经完成,结合文献的报道,我们筛选了十种与GBS毒力作用相关的蛋白进行结构生物学研究,这十种蛋白包括负责合成GBSβ-haemolysis的cyl操纵子上的cylA、cylB和cylE,还有一些与GBS毒性相关的表面蛋白,这些表面蛋白对GBS的生长和毒性具有不可或缺的作用。我们试图利用结构生物学的手段探究这些蛋白发挥毒力作用的结构基础,希望通过结构分析找到这些蛋白上的潜在靶向药物作用位点,为新型抗菌药物的开发与设计提供理论依据。于是,我们将这十种毒力蛋白分别进行了分子克隆、大量表达与纯化,并对纯化得到的高纯度蛋白进行大规模的晶体筛选。最后,有两种表面蛋白收集了衍射数据,通过对衍射数据的处理获得了初步的结构信息。2.免疫卡控点TIGIT抗原表位和抗体CDR序列的初步研究近年来,针对免疫细胞共抑制性受体的免疫卡控点治疗在肿瘤免疫治疗中取得了巨大进展。免疫卡控点治疗与传统治疗方法的区别在于,它不是以肿瘤细胞作为靶点,而是以免疫细胞表面的抑制性受体为靶点,通过抑制这种受体来激活免疫细胞抗肿瘤活性,研究最多的这种抑制性受体是CTLA4,PD-1,目前针对它们的单抗药物已经在临床实验中取得了初步成功。但是这些抗体药物还具有局限性和副作用,所以发现和验证新的共抑制性受体成为一个全球竞争性的热点。TIGIT是2009年被发现的位于NK细胞和T细胞表面的共抑制性受体,目前研究表明阻断TIGIT的单克隆抗体,在动物模型中具有很好的抗癌效果,所以TIGIT是一个很具潜力的免疫治疗新靶点,但国内外还没有针对TIGIT受体的抗体药物上市,因此亟须开展高效特异性TIGIT单克隆抗体的研发。该研究课题主要围绕TIGIT单克隆抗体与TIGIT复合物结构展开,希望能通过解析复合物晶体结构来发现TIGIT单抗高变识别区(CDR)序列和TIGIT靶点的抗原表位,然后再基于结构改造获得更高亲和力的TIGIT单抗序列。在本课题中,我们构建了鼠和人TIGIT的原核表达体系,对TIGIT进行了表达和纯化；从裸鼠腹水中纯化TIGIT单抗,并构建了抗体Fab段的原核分泌型表达体系,进行原核纯化。
【关键词】：B型链球菌 cylA cy1B cylE 表面蛋白 毒力因子 免疫卡控点 TIGIT 单克隆抗体 抗原表位 高变识别区
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.12
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一部分 GBS毒力因子的初步晶体学研究12-58
• 第一章 绪论12-20
• 1.1 引言12-14
• 1.1.1 B型链球菌概述12-13
• 1.1.2 GBS毒力机制及毒力因子概述13-14
• 1.2 β-haemolysin/cytolysin14-17
• 1.2.1 β-haemolysin/cytolysin概述14-15
• 1.2.2 cyl操纵子15-17
• 1.3 GBS pigment17-19
• 1.3.1 GBS pigment研究进展17-18
• 1.3.2 GBS pigment毒力机制18-19
• 1.4 研究目的与研究意义19-20
• 第二章 实验材料与方法20-40
• 2.1 实验材料与仪器设备20-21
• 2.1.1 菌株和载体20
• 2.1.2 酶与其它试剂20
• 2.1.3 仪器设备20-21
• 2.2 生物信息学分析21
• 2.3 B型链球菌相关毒力因子的基因克隆与重组质粒的构建21-29
• 2.3.1 引物设计21-22
• 2.3.2 PCR反应及产物回收22-23
• 2.3.3 双酶切法构建重组质粒23-25
• 2.3.4 Gibson assembly法构建重组质粒25-26
• 2.3.5 重组质粒转化感受态DH5α26-28
• 2.3.6 阳性克隆的筛选鉴定及质粒抽提28-29
• 2.4 GBS毒力因子的表达与纯化29-35
• 2.4.1 目的蛋白的表达检测与鉴定29-31
• 2.4.2 目的蛋白的大量表达31-33
• 2.4.3 目的蛋白的分离与纯化33-35
• 2.4.4 浓缩、蛋白浓度测定35
• 2.5 晶体学实验方法解析蛋白三维结构35-40
• 2.5.1 蛋白结晶筛选35-37
• 2.5.2 晶体冻存37-38
• 2.5.3 衍射数据的收集38-39
• 2.5.4 衍射数据的处理39-40
• 第三章 实验结果与讨论40-55
• 3.1 GBS毒力因子的质粒构建与表达检测结果40
• 3.2 GBS毒力因子的纯化40-49
• 3.2.1 cylA蛋白的纯化结果40-43
• 3.2.2 Maltose binding protein的纯化43-44
• 3.2.3 SeMet-maltose binding protein的纯化44-45
• 3.2.4 Oligopeptide binding protein的纯化45-46
• 3.2.5 SeMet-Oligopeptide binding protein的纯化46-47
• 3.2.6 Surface immunogenic protein的纯化47-48
• 3.2.7 Putative pathogenicity protein的纯化48-49
• 3.3 蛋白晶体的生长49-52
• 3.3.1 Maltose binding protein晶体筛选与优化49-50
• 3.3.2 Oligopeptide binding protein晶体初筛与优化50-51
• 3.3.3 SeMet-Oligopeptide binding protein的初筛与优化51-52
• 3.4 衍射数据的收集与处理52-55
• 3.4.1 Maltose binding protein数据的收集与处理52-53
• 3.4.2 Oligopeptide binding Protein的数据收集与处理53-55
• 本篇小结55-56
• 参考文献56-58
• 第二篇 免疫卡控点TIGIT抗原表位和抗体CDR序列的研究(合作项目)58-83
• 第四章 研究背景58-65
• 4.1 免疫卡控点治疗58-60
• 4.1.1 免疫卡控点CTLA-4和PD158-59
• 4.1.2 基于CTLA-和PD1的免疫治疗59-60
• 4.2 新型免疫细胞表面抑制性受体TIGIT60-62
• 4.2.1 TIGIT研究背景介绍60-61
• 4.2.2 TIGIT是极具潜力的免疫治疗的新靶点61-62
• 4.3 TIGIT和CD226结构研究状况62-64
• 4.4 研究目的与研究意义64-65
• 第五章 实验方法65-72
• 5.1 生物信息学获取65
• 5.2 TIGIT与CD226分子克隆及重组质粒的构建65-66
• 5.3 TIGIT与CD226蛋白的表达检测与大规模培养66
• 5.4 重组蛋白的表达与纯化66-70
• 5.4.1 mTIGIT IgV的表达纯化66-70
• 5.4.2 hTIGIT蛋白的表达纯化70
• 5.5 mTIGIT单克隆抗体的纯化70-72
• 第六章 结果与讨论72-80
• 6.1 mTIGIT蛋白的结果分析72-76
• 6.1.1 mTIGIT氨基酸序列的生物信息学分析72-73
• 6.1.2 mTIGIT基因的分子克隆与质粒构建73
• 6.1.3 mTIGIT蛋白表达检测结果73-74
• 6.1.4 mTIGIT的纯化结果74-75
• 6.1.5 mTIGIT的质谱鉴定结果75-76
• 6.2 hTIGIT蛋白的结果分析76-78
• 6.2.1 hTIGIT的分子克隆与质粒构建76
• 6.2.2 hTIGIT基因的表达检测76-77
• 6.2.3 hTIGIT蛋白的纯化结果77-78
• 6.3 mTIGIT单克隆抗体的纯化结果78-80
• 本篇小结80-81
• 参考文献81-83
• 附录83-86
• 致谢86

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本文编号：251930