SOS应答对大肠杆菌抗药性与毒力的调控机制

发布时间：2017-03-16 15:00

  本文关键词：SOS应答对大肠杆菌抗药性与毒力的调控机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：SOS应答系统普遍存在于细菌,是受到RecA-LexA调控的一种低保真度DNA修复方式。在正常状态下,阻遏蛋白LexA二聚体结合在细菌SOS应答基因的启动子区域,抑制基因表达；当细菌处于应激状态,形成的单链DNA激活启动蛋白RecA,解除LexA的阻遏,SOS应答系统控制的许多关键基因得以表达,产生一系列可能适应环境压力的突变和适应反应。抗生素频繁使用造成了新的生境,病原菌同时面临抗生素和宿主免疫系统的双重抑制作用,必然需要协调和控制其抗药性和毒力。因此,本文构建SOS应答抑制模型,探索抗药性、耐药性与毒力在进化通路上的相关性。一、recA缺失使菌株对恩诺沙星的抗药性和抗药率均明显降低。本文以大肠杆菌ATCC 25922和0157：H7为野生型菌株,通过Red重组系统,敲除两个菌株的recA基因,成功构建了recA缺失菌株ATCC 25922/△recA和0157:H7/△recA,利用荧光定量PCR测定SOS应答系统相关基因recA和umuC在恩诺沙星压力下表达量的变化,结果显示recA基因缺失抑制umuC表达,关闭了SOS应答。微量肉汤稀释法药敏试验结果表明,recA缺失菌株对恩诺沙星的MIC值比野生型菌株降低至1/8；梯度平板检测表明,药物诱导ATCC 25922/△recA较野生型菌株不易产生抗药性变异。二、recA缺失对菌株毒力的影响。利用real-time PCR方法研究不同条件下0157：H7的主要毒力基因stx2和eaeA表达量的变化,恩诺沙星作用能够提高stx2和eaeA的表达,敲除recA后,stx2表达量下调,但eaeA表达量上调；体外细胞试验确定recA缺失能够降低stx2的表达,但却提高eaeA的表达量。三、通过0157：H7及其recA缺失菌株的转录组分析,探讨SOS应答系统对0157：H7抗药性和毒力的调控作用。共发现20个可能受SOS调控系统的主要基因,在恩诺沙星处理下表现为表达显著地上调或下调,推测有6个转录子与细菌的耐药性、抗药性有关,2个转录子与与毒力调控相关,3个与核苷酸代谢有关,3个在信号通路的上游。其中粘附素基因eaeA,在转录组分析、荧光定量验证和体外细胞验证中,同时得到印证：此基因由SOS应答系统调控,SOS系统启动导致O157：H7中粘附素基因的下调表达,使细菌对细胞的粘附力减弱。四、SOS应答抑制剂在以上研究基础上,合成了RecA蛋白抑制剂,它与恩诺沙星联合使用对E. coli生长具有相加抑制作用,荧光定量PCR检测表明RecA抑制剂能够一定程度上抑制恩诺沙星诱导的recA、umuC、edeA、stx2的表达。
【关键词】：E.coli SOS应答系统 recA基因 抗药性 毒力 RecA抑制剂
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.21
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 符号说明11-12
• 第一章 文献综述12-24
• 1.1 细菌抗药性毒力及其相关性12-16
• 1.1.1 细菌抗药性12-13
• 1.1.2 细菌毒力13-14
• 1.1.3 细菌抗药性与毒力的相关性14-16
• 1.2 细菌中的SOS应答系统16-20
• 1.2.1 SOS应答的发现16
• 1.2.2 SOS应答的诱导信号及启动的一般途径16-18
• 1.2.3 SOS应答关键基因及其表达产物的功能18-20
• 1.3 SOS应答系统对抗药性与毒力的调控作用20-22
• 1.3.1 SOS应答对细菌抗药性表型的影响20-21
• 1.3.2 SOS应答对细菌毒力的影响21-22
• 1.4 抑制SOS应答在治疗感染中的应用潜力22-23
• 1.5 问题与展望23-24
• 第二章 recA缺失菌株的构建24-35
• 2.1 材料与方法24-29
• 2.2 结果与分析29-33
• 2.2.1 显色培养基的鉴定结果29
• 2.2.2 生理生化鉴定结果29
• 2.2.3 16S rDNA分析29-31
• 2.2.4 recA基因敲除的鉴定31-33
• 2.2.5 Escherichia coli生长曲线测定结果33
• 2.3 讨论与结论33-35
• 2.3.1 讨论33-34
• 2.3.2 结论34-35
• 第三章 recA缺失对Escherichia coli抗药性的影响35-44
• 3.1 材料与方法35-39
• 3.2 结果与分析39-42
• 3.2.1 ATCC 25922/△recA和O157：H7/△recA对恩诺沙星等抗生素的MIC的测定39-40
• 3.2.2 recA缺失对抗药性变异的影响40
• 3.2.3 SOS应答系统基因recA和umuC表达量测定40-42
• 3.3 讨论与结论42-44
• 3.3.1 讨论42-43
• 3.3.2 结论43-44
• 第四章 recA缺失对Escherichia coli毒力的影响44-53
• 4.1 材料与方法45-49
• 4.2 结果与分析49-52
• 4.2.1 毒力基因测定49
• 4.2.2 毒力基因表达量测定49-50
• 4.2.3 细胞粘附试验50
• 4.2.4 细胞毒试验50-52
• 4.3 讨论与结论52-53
• 4.3.1 讨论52
• 4.3.2 结论52-53
• 第五章 RecA抑制剂对SOS应答的影响53-61
• 5.1 材料与方法53-55
• 5.2 结果与分析55-59
• 5.2.1 RecA抑制剂N~6-(1-Naphthyl)-ADP的核磁共振鉴定55-56
• 5.2.2 恩诺沙星与抑制剂联合抑菌作用56-57
• 5.2.3 SOS相关基因表达量变化57-59
• 5.3 讨论与结论59-61
• 5.3.1 讨论59-60
• 5.3.2 结论60-61
• 第六章 SOS应答对O157：H7抗药性和毒力的调控作用61-75
• 6.1 材料与方法61-63
• 6.2 结果与分析63-72
• 6.2.1 测序数据统计63-67
• 6.2.2 正常生长条件下O157：H7中recA基因的功能67-68
• 6.2.3 SOS应答系统对O157：H7抗药性耐药性和毒力的调控68-72
• 6.3 讨论与结论72-75
• 6.3.1 讨论72-73
• 6.3.2 结论73-75
• 全文总结75-77
• 参考文献77-83
• 致谢83-84
• 主要发表论文84-85
• 附件85

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 刘丽;;浅析细菌耐药机理与抗生素的合理应用[J];中国伤残医学;2007年04期

2 张小林,汪复,朱德妹;多重耐药大肠杆菌外膜屏障机制的研究[J];中华传染病杂志;1998年04期

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本文编号：251894