溪黄草水提液对胆汁淤积大鼠模型药效作用机制及PK-PD研究

发布时间：2017-03-16 17:07

  本文关键词：溪黄草水提液对胆汁淤积大鼠模型药效作用机制及PK-PD研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：研究溪黄草水提液(XHC)及活性成分迷迭香酸(Rosmarinicacid,RosA)对α-萘异硫氰酸酯(alpha-naphthylisothiocyanate,ANIT)诱发胆汁淤积性肝损伤的保护作用及对法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)和转运体胆盐输出泵(Bilesalt export pump,BSEP)、多药耐药相关蛋白2(Multidrug resistance protein 2,MRP2)基因转录水平和蛋白表达的影响。方法：1.XHC及其RosA的急性毒性实验研究经LD50预试显示二者毒性较低,无法检测出LD50，，故测定XHC及RosA的日内最大给药量,并连续观察与记录14天动物一般活动状态(动物外观、行为),肝脏行病理观察。2.建立溪黄草中咖啡酸、夏佛塔苷、阿魏酸、牡荆苷、迷迭香酸的HPLC-UV测定方法并对其进行提取工艺的考察建立简单、快速、灵敏的HPLC-UV检测方法,对溪黄草原药材中主要水溶性成分进行含量测定,比较蒸馏水煎煮法、100%甲醇超声提取方式、50%、70%、95%乙醇提取方式对溪黄草成分含量的影响。3.观察XHC及RosA对ANIT诱发的大鼠胆汁淤积模型的影响大鼠一次灌胃ANIT造成急性肝内胆汁淤积模型,空白对照组、模型对照组(80mg·kg-1ANIT)、XHC氏剂量组(25g生药kg-1)、XHC中剂量组(40g生药·kg-1)、XHC高剂量组(80g生药kg-1)、RosA低剂量组(25mg·kg-1)、RosA中剂量组(50mg·kg-1)、RosA高剂量组(100mg·kg-1),阳性对照组(100mg·kg-1雄去氧胆酸),按灌胃体积10mL·kg-1连续给药7天后测定胆汁流量、胆汁成分中总胆红素(Total bilirubin, TBIL)、总胆汁酸(Total bile acid,TBA)、检测肝功能血清中天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate transaminase, AST)、丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase, ALT)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、直接胆红素(Direct bilirubin, DBIL)、总胆红素(Total bilirubin, TBIL)、总胆汁酸(Total bile acid,TBA)指标和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)指标、肝脏组织抗氧化酶(MDA、SOD GSH)指标,对肝脏组织进行病理学检查、对肝细胞进行超微结构检查,并对肝脏中胆汁酸核受体FXR、转运体MRP2和BSEP的基因转录水平及其蛋白表达量的影响。4. RosA在大鼠体内药物动力学及药动-药效学研究建立RosA体内HPLC-UV检测方法,采用灌胃给药方式,对预定时间的生物样品中RosA的含量进行测定,计算药物动力学参数。此外,进行预定时间的灌胃RosA药物动力学-药物效应动力学观察,进一步研究药物的血药浓度对药效的影响。结果：1.在XHC和RosA最大给药量试验中,确定XHC最大给药量是800g生药/kg, RosA最大给药量是5g/kg。病理检查显示,RosA雄性小鼠组有肝组织细胞病变(脂肪空泡形成、轻度水肿),其它组均无肝组织细胞病变。2.XHC质量控制以RosA和咖啡酸的含量为评价指标,同时测定XHC中咖啡酸、夏佛塔苷、阿魏酸、牡荆苷、迷迭香酸等5个水溶性成分的含量分别为4.43%、1.15%、1.14%、0.52%、5.17%。3.在XHC和RosA对ANIT诱发的胆汁淤积模型的影响实验中,病理检查结果显示,与模型对照组比较,XHC中、高剂量组、阳性对照组、RosA低、中、高剂量组可使肝小叶结构逐渐趋于正常,肝细胞排列逐渐趋于整齐,未见明显变性、坏死,汇管区也未见明显炎症细胞浸润。电镜结果显示XHC、RosA各剂量组及阳性对照组均能较大幅度降低肝细胞内脂滴数量,使线粒体形态及核膜有明显的改善。另一方面,在肝血清及组织生化指标血清酶(ALT、AST、ALP、TC、 DBIL、TBIL、TBA)、血清中抗氧化酶(MDA、SOD、GSH)、肝组织中抗氧化酶(MDA、SOD、GSH)、胆汁流量、胆汁成分(TBIL、TBA)等方面,XHC中、高剂量,RosA低、中、高剂量、阳性对照组等各组均具有对肝脏保护及促进胆汁分泌的显著作用(P0.05),具有统计学意义。XHC低剂量组对胆汁流及血清中总胆红素,直接胆红素、胆汁酸有改善作用(P0.05),具有统计学意义。从基因转录和蛋白表达上看,与模型对照组相比,除XHC低剂量组外XHC各剂量组均能显著上调肝核受体FXR和细胞膜转运体BESP、MRP2基因转录与蛋白的表达(P0.05),差异具有统计学意义；RosA各剂量组及阳性对照组也能显著上调肝细胞膜转运体FXR和转运体BESP、MRP2基因转录与蛋白的表达,有利于恢复胆汁酸的正常代谢。实验结果说明XHC和RosA对ANIT诱发的实验性大鼠肝内胆汁淤积有保护肝脏及提高胆汁分泌排泄的作用。4.RosA在大鼠体内药物动力学及药动-药效学研究中,灌服RosA后采用PK-solution2.0软件计算药动学参数。从药动学参数表中可以得出灌胃100mg/kg。 RosA在正常对照组大鼠体内的AUC(0-∞)=17.29mg·h/mL。ANIT诱发大鼠胆汁淤积模型后,RosA在大鼠体内的AUC明显增加,AUC(0-∞)= 23.11 mg·h/mL。其原因可能是胆汁淤积导致肝组织损伤,胆汁排泌明显下降,从而导致药物的蓄积,容易引起肝毒性。胆汁中TBIL、TBA与肝功能血清酶AST、ALT在灌胃后1.5h左右改善最为明显,TBIL、TBA的E-C曲线呈明显的逆时针环,TBIL、TBA效应变化明显滞后于血药浓度。AST、ALT的E-C曲线呈明显的顺时针环,与随着时间增加,RosA逐渐发挥最大药理活性,抑制AST、ALT的上升,药物发挥药理作用需要一定的时间。结论：对ANIT诱发大鼠胆汁淤积急性肝损伤模型的实验,XHC及其主要活性成分RosA能较明显改善血清中肝功能生化指标(ALT、AST、ALP、TC、DBIL、 TBIL、TBA)、抗氧化酶指标(MDA、SOD、GSH),改善肝组织中抗氧化酶指标(MDA、SOD、GSH),改善胆汁中成分(TBIL、TBA)的含量,胆汁的分泌、同时抑制肝细胞炎症状态,保护肝细胞结构(如线粒体等重要细胞器),因而具有显著保肝利胆作用。其作用机制之一是通过上调胆汁排泄核受体FXR基因转录和蛋白表达,然后进一步调控BSEP和MRP2的基因转录和蛋白表达的上调来发挥其保肝利胆、抗胆汁淤积的作用。
【关键词】：胆汁淤积 溪黄草 迷迭香酸
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285.5;R-332
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 第一章 文献研究14-22
• 第一节 溪黄草研究现状14-15
• 一、溪黄草概述14
• 二、溪黄草的有效成分及生物活性14
• 三、药理作用14-15
• 第二节 胆汁淤积研究现状15-21
• 一、中医对胆汁淤积的认识15
• 二、胆汁的分泌及胆汁酸合成15-16
• 三、胆汁酸转运及胆汁酸盐转运体的分子特征16-17
• 四、胆汁淤积的发病机制17-18
• 五、法尼醇X受体(FXR)18
• 六、FXR在胆汁酸代谢中的地位以及胆汁酸盐转运体18-19
• 七、线粒体功能与胆汁酸代谢19-20
• 八、实验性肝内胆汁淤积病理模型的建立20
• 九、熊去氧胆酸治疗胆汁淤积性肝病20
• 十、药效-药动学(PK-PD)模型20-21
• 第三节 小结21-22
• 第二章 实验研究22-71
• 第一节 XHC水提液与迷迭香酸急性毒性试验22-27
• 一、实验目的22
• 二、实验材料22
• 三、实验方法22-24
• 四、实验结果24-25
• 五、讨论25-27
• 第二节 HPLC法测定XHC中5种主要有效成分及XHC提取工艺考察27-34
• 一、实验目的27
• 二、实验材料27
• 三、实验方法与结果27-33
• 四、讨论33-34
• 第三节 XHC及RosA对ANIT诱发大鼠胆汁淤积模型的影响34-46
• 一、实验目的34
• 二、实验材料34
• 三、实验方法34-36
• 四、实验结果36-43
• 五、讨论43-46
• 第四节 溪黄草主要有效成分迷迭香酸药物动力学46-52
• 一、实验目的46
• 二、实验材料46
• 三、实验方法46-49
• 四、实验结果49-50
• 五、讨论50-52
• 第五节 溪黄草主要有效成分RosA PK-PD药动-药效学模型研究52-63
• 一、实验目的52
• 二、实验材料52
• 三、实验方法52-53
• 四、实验结果53-60
• 五、讨论60-63
• 第六节 XHC及RosA对ANIT诱发大鼠胆汁淤积模型肝组织FXR、BSEP、MRP2蛋白表达的影响63-67
• 一、实验目的63
• 二、实验材料63
• 三、实验方法63-64
• 四、实验结果64-66
• 五、讨论66-67
• 第七节 RT-PCR法检测XHC及RosA对大鼠肝脏组织FXR、BSEP、MRP2 MRNA表达的影响67-71
• 一、实验目的67
• 二、实验材料67
• 三、实验方法67-68
• 四、实验结果68-70
• 五、讨论70-71
• 结语71-73
• 参考文献73-77
• 附录77-79
• 在校期间发表论文情况79-80
• 致谢80-81
• 统计学审核证明81

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本文编号：252065