PGC-1α通过线粒体ROS和ATP在CH1细胞中调控细胞周期机制研究
本文关键词：PGC-1α通过线粒体ROS和ATP在CH1细胞中调控细胞周期机制研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)是细胞能量的主要来源,受损导致ATP产量降低和活性氧ROS的过量产生,进而影响细胞生长和代谢。Bcl-2定位于线粒体,可消除线粒体ROS积累；而PGC.1a(过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子-1α)是能量调控途径中的一个关键因子,主要存在于细胞核,亦定位于线粒体。但Bcl-2与PGC.1a之间是否相互作用,及PGC-1α调控能量代谢的机制仍不清楚。因此,本研究旨在调查PGC-1α是否通过调控线粒体ATP和ROS水平继而调控细胞周期,以及与Bcl-2是否存在直接或间接关系。首先我们于小鼠胚胎成纤维CH1细胞中,通过转基因技术高表达PGC-1α, siRNA干扰方法降低PGC-1α表达,同时转染空质粒pBABE-neO作为对照组,然后使用流式细胞术检测细胞周期、ROS以及ATP水平。我们发现过表达PGC-1α具有升高ATP、降低ROS和促进细胞周期的作用。Westem Blot结果显示PGC-1α高表达时,细胞周期蛋白CyclinB1/D1含量也随之升高。随之我们分别改变ATP和ROS,检测二者是否通过影响细胞周期蛋白作用于细胞周期。结果显示用寡霉素抑制CH1PGC-1α细胞中ATP生成,CyclinD1显著下调；加入H2O2提高ROS后CyclinB 1显著下调。为检测Bcl-2与PGC-1α的相关性,我们于小鼠胚胎成纤维NIH3T3细胞中成功构建了Bcl-2稳定高表达细胞株及PB对照组,PGC-lα表达量在正常生长的Bcl-2细胞和PB对照间无差异；而采用接触抑制或血清饥饿法同步化细胞在GO期时,Bcl-2细胞中PGC-1α蛋白表达量明显高于对照组；另外,在U251细胞中干扰下调Bcl-2表达,PGC-1α表达量降低,表明Bcl-2正调控PGC-1α。U251细胞中Bcl-2与PGC-1α均内源性高表达,血清饥饿同步化过程中,随时间延长,PGC-1α表达量下调,Bcl-2表达量逐渐升高；通过siRNA干扰下调PGC-1α表达,Bcl-2表达量显著性升高。说明PGC-1α负反馈Bcl-2的表达变化。我们通过免疫共沉淀进一步检测Bcl-2与PGC-1α是否相互结合,结果显示全长PGC-1α(110kD)并不与Bcl-2结合,但在70KDa处检测到特异性条带,通过查阅文献我们猜测其为PGC-1α新型剪切体,具体物质还有待进一步研究证明。综上所述,我们发现PGC-1α调控细胞周期是通过升高ATP水平抑制CyclinD1表达,同时降低ROS水平促进CyclinB1表达而实现。并且PGC-1α可能通过一种新型剪切体与Bcl-2结合,二者共同作用于线粒体途径,决定细胞的命运。以上发现有望揭示PGC-1α调控线粒体能量代谢的途径,并与Bcl-2通过线粒体通路调控癌症相关联,继而为发现新的药物靶点,改善线粒体疾病提供可行性研究。
【关键词】：PGC-1α 线粒体 氧化磷酸化 ATP ROS 细胞周期 CyclinD1 CyclinB1 Bcl-2
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：
- 摘要4-6
- Abstract6-8
- 缩略词对照表8-13
- 第一章 前言13-23
- 1 线粒体13-15
- 1.1 线粒体氧化磷酸化13-14
- 1.2 线粒体ROS产生14-15
- 1.3 线粒体与细胞周期关系15
- 2 PGC-1α研究现状15-19
- 2.1 PGC-1α15-16
- 2.2 PGC-1α与线粒体关系16-18
- 2.3 PGC-1α与能量调控关系18
- 2.4 PGC-1α剪切体的出现18-19
- 3 Bcl-2研究现状19-22
- 3.1 Bcl-2双重功能20-22
- 3.1.1 Bcl-2原癌功能20-22
- 3.1.2 Bcl-2抑癌功能22
- 4 本研究目的和意义22-23
- 第二章 PGC-1α通过线粒体ROS及ATP调控CH1细胞周期23-49
- 1 材料23-26
- 1.1 细胞株23
- 1.2 主要试剂及耗材23-24
- 1.3 药品及试剂盒24
- 1.4 常用试剂配制24-25
- 1.5 主要仪器25-26
- 2 实验方法26-35
- 2.1 构建PGC-1α稳定表达细胞株26-27
- 2.1.1 细胞培养26
- 2.1.2 病毒包装和感染26-27
- 2.1.3 感染后细胞的筛选与冻存27
- 2.2 Western Blot检测PGC-1α表达27-30
- 2.2.1 Western Blot实验步骤27-29
- 2.2.2 检测稳定转染细胞株PGC-1α蛋白表达29-30
- 2.3 瞬时干扰PGC-1α30-31
- 2.3.1 干扰片段的合成30
- 2.3.2 转染30-31
- 2.4 细胞计数31
- 2.5 PGC-1α对线粒体ROS、细胞内ATP及细胞增殖的影响31-33
- 2.5.1 流式细胞仪检测细胞中线粒体ROS31-32
- 2.5.2 PGC-1α对细胞内ATP含量的影响32-33
- 2.5.3 MTS检测PGC-1α对细胞增殖的影响33
- 2.6 流式细胞术检测PGC-1α高表达及干扰处理后细胞周期时相变化33
- 2.7 PGC-1α高表达及干扰处理后检测CyclinB1及CyclinD1变化33
- 2.8 改变细胞ATP对CyclinB1、CyclinD1及细胞周期的影响33-34
- 2.8.1 降低CH1PGC-1α细胞株ATP后检测CyclinB1/D1蛋白变化33-34
- 2.8.2 降低CH1PGC-1α细胞ATP后流式检测细胞周期变化34
- 2.9 改变ROS对CyclinD1、CyclinB1及细胞周期的影响34-35
- 2.9.1 升高CH1PGC-1α细胞株ROS后检测CyclinB1/D1蛋白变化34
- 2.9.2 升高CH1PGC-1α细胞株ROS后流式检测细胞周期变化34-35
- 3 结果35-45
- 3.1 构建PGC-1α稳定高表达和瞬时干扰细胞系35-37
- 3.1.1 蛋白水平检测稳定感染后PGC-1α蛋白表达变化35-37
- 3.1.2 检测瞬时干扰PGC-1α蛋白37
- 3.2 高表达和干扰PGC-1α后检测其对线粒体及细胞功能的影响37-39
- 3.3 高表达和干扰PGC-1α后检测细胞周期及cylinD1/B1变化39-41
- 3.4 寡霉素处理CH1PGC-1α细胞检测细胞周期和CyclinD1/B1蛋白变化41-43
- 3.5 H_2O_2处理CH1PGC-1α细胞检测细胞周期和CyclinD1/B1蛋白变化43-45
- 4 讨论45-47
- 5 结论47-49
- 第三章 Bcl-2与PGC-1α相互调节49-72
- 1 材料49-51
- 1.1 细胞株49
- 1.2 主要试剂49-50
- 1.3 仪器设备及耗材50-51
- 2 方法51-56
- 2.1 构建Bcl-2稳定表达细胞株51-52
- 2.1.1 细胞培养51
- 2.1.2 病毒包装和感染51-52
- 2.1.3 感染后细胞的筛选与冻存52
- 2.2 同步化处理细胞后检测PGC-1α蛋白变化52
- 2.3 同步化后于U251cell中检测Bcl-2和PGC-1α表达量变化52-53
- 2.4 干扰处理Bcl-2检测PGC-1α变化53-54
- 2.4.1 干扰片段合成53
- 2.4.2 转染后检测PGC-1α表达量53-54
- 2.5 干扰处理PGC-1α检测Bcl-2变化54
- 2.6 免疫共沉淀检测Bcl-2与PGC-1α是否结合54-55
- 2.6.1 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)54-55
- 2.6.2 Western Blot上样检测Bcl-2与PGC-1α55
- 2.7 肽指纹图谱检测阳性未知蛋白55-56
- 3 结果56-70
- 3.1 血清饥饿处理后,Bcl-2细胞中PGC-1α蛋白表达上调56-58
- 3.2 接触抑制处理后,Bcl-2细胞中PGC-1α蛋白表达上调58-60
- 3.3 血清饥饿处理U251细胞,Bcl-2和PGC-1α蛋白表达量相关60-61
- 3.4 瞬时干扰后检测Bcl-2和PGC-1α蛋白变化61-65
- 3.4.1 瞬时干扰Bcl-2后,PGC-1α蛋白下调61-63
- 3.4.2 瞬时干扰PGC-1α后,Bcl-2表达上调63-65
- 3.5 免疫共沉淀检测Bcl-2于PGC-1α是否结合65-67
- 3.5.1 NIH3T3Bcl-2细胞中,Bcl-2和PGC-1α的新剪切体结合65-66
- 3.5.2 U251细胞中,Bcl-2和PGC-1α的新剪切体结合66-67
- 3.6 质谱检测未知阳性蛋白为PKM267-69
- 3.7 免疫共沉淀未检测到Bcl-2与PKM2相互结合69-70
- 4 讨论70-71
- 5. 结论71-72
- 附录72-74
- 相关试剂配方72-74
- 参考文献74-81
- 硕士学位期间科研成果81-82
- 致谢82-83
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3 $$点评人：陆佳韵（现为中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点试验室博士生） $$吴eㄖ泄窖Э蒲г褐琢鲅芯克赴锸抑魅危夜窖б糯У牡旎酥唬
本文编号：252103
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