补体C3对巨噬细胞本身自噬及其自噬弓形虫的影响和机制初探

发布时间：2017-03-16 18:07

  本文关键词：补体C3对巨噬细胞本身自噬及其自噬弓形虫的影响和机制初探，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：自噬对细胞生存、生长及维持自身稳态是十分重要的。自噬不但是细胞自身防御和应激的调控机制,而且与固有免疫及适应性免疫有着密切联系,并且外源病原体感染可以诱发细胞发生自噬。目前已证实,自噬与TLR、NLR、RLR等固有免疫组成部分都有密切的相互作用关系。补体系统作为固有免疫的重要组成部分能够通过经典途径、凝集素途径及旁路途径被激活。这三条途径均导致C3被活化,并产生活性片段C3a和C5a,进而形成C5-C9攻膜复合物。C3a和C5a都能通过分别与C3a R和C5aR结合来诱导产生炎性因子。然而补体与自噬之间的关系尚未见报道。本课题首先利用表达EGFP的荧光弓形虫及C3-/-C57 BL6/J小鼠构建了弓形虫入侵小鼠腹腔巨噬细胞发生自噬的实验平台,利用Western、激光共聚焦及透射电子显微镜等实验手段观察对比C3-/-组与对照组自噬水平的变化差异,用流式细胞术及激光共聚焦的方法来观察宿主细胞自噬对巨噬细胞杀伤弓形虫能力的影响。结果显示,局部补体C3不仅能够抑制巨噬细胞自身的经典自噬水平还能抑制巨噬细胞自噬弓形虫的水平,并且补体C3对宿主细胞自噬水平的抑制能够抑制IFN-γ清除弓形虫。然后我们还对C3负调节巨噬细胞自噬的机制进行了初步探讨。这一现象的发现丰富了我们对自噬与固有免疫之间关系的认识,并十分有利于我们深入理解自噬相关疾病的发病机制。一、局部产生的补体C3抑制巨噬细胞的经典自噬及选择性自噬1.局部产生的补体C3抑制巨噬细胞的经典自噬:收集HBSS培养巨噬细胞0h、3h、6h、12h、24h的蛋白,通过Western检测自噬标志蛋白LC3及LAMP-1的表达情况,结果发现C3-/-组LC3 II/I及LAMP-1的水平明显高于对照组。2.局部补体C3能抑制巨噬细胞自噬弓形虫:弓形虫入侵巨噬细胞不同时间点分别利用激光共聚焦观察统计LC3及LAMP-1与被巨噬细胞自噬的弓形虫的共聚率及荧光强度,结果发现C3-/-组明显高于对照组,Western检测LC3、LAMP-1及P62蛋白表达量,结果显示C3-/-细胞中LAMP-1、LC3II/LC3I明显高于WT,而P62则低于WT。3.局部产生的补体C3通过抑制自噬而抑制IFN-γ清除弓形虫:激光共聚焦及流式细胞术结果分析得出,在C3-/-细胞中弓形虫的感染率和平均虫数都低于WT细胞。共聚焦结果显示自噬促进剂Rapamycin和自噬抑制剂3-MA分别能增强和抑制LC3和LAMP-1与弓形虫的共聚,这说明m TOR和PI3k信号通路影响了巨噬细胞的特异性自噬。并且自噬抑制剂wortmannin能够逆转C3抑制IFN-γ杀伤胞内弓形虫的作用,这一结果说明局部产生的C3是通过抑制自噬来发挥抑制IFN-γ清除弓形虫的作用的。二、补体C3影响巨噬细胞自噬水平的机制初步探讨1.被弓形虫速殖子入侵的巨噬细胞中补体活化并产生C3a:ELISA方法检测细胞培养基上清中补体C3a的表达水平,对照组细胞随时间延长C3a表达水平逐渐升高,C3-/-组中的C3a表达水平几乎为零。2.C5a/C5aR信号通路可能不影响巨噬细胞自噬弓形虫的水平:利用共聚焦显微镜统计LC3及LAMP-1与入侵巨噬细胞的弓形虫速殖子共聚率得出,C5aR-/-组与对照组无统计学差异。本研究首次报道了补体C3能够负调节巨噬细胞自噬,并且能够抑制IFN-γ清除胞内弓形虫。这丰富了我们对固有免疫与自噬之间关系的认识,并且十分有助于我们理解相关疾病的发病机制。
【关键词】：自噬 巨噬细胞 弓形虫 补体C3
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392.12
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-14
• 1.1 选题缘由11-12
• 1.2 研究背景12
• 1.3 研究意义12
• 1.4 研究内容与方法12-14
• 第二章 补体C3影响巨噬细胞本身自噬及其特异自噬弓形虫水平14-32
• 2.1 材料与方法14-18
• 2.2 方法18-23
• 2.3 实验结果23-30
• 2.4 讨论30-32
• 第三章 补体C3影响巨噬细胞自噬水平的机制初步探讨32-38
• 3.1 材料与方法32-33
• 3.2 方法33-35
• 3.3 实验结果35-37
• 3.4 讨论37-38
• 全文总结38-39
• 参考文献39-41
• 文献综述 弓形虫自噬的研究进展41-47
• 参考文献45-47
• 攻读硕士学位期间的研究成果47-48
• 致谢48

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