汉滩病毒重组假病毒的构建及包膜蛋白糖基化对病毒免疫学性状影响的初步研究

发布时间：2017-03-16 18:07

  本文关键词：汉滩病毒重组假病毒的构建及包膜蛋白糖基化对病毒免疫学性状影响的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：病毒包膜蛋白是镶嵌于病毒脂质双层膜中各种蛋白质分子的统称,由于糖基化修饰普遍存在于各种病毒的包膜蛋白,因此病毒包膜蛋白常被称为病毒包膜糖蛋白(Envelope glycoprotein, GP),在病毒结构蛋白中占有重要的地位。迄今为止的研究表明：病毒GP分子表面糖侧链的种类、糖基化的方式及糖基化程度对病毒的致病性、病毒颗粒的组装、成熟、释放、病毒的免疫逃避、抗病毒免疫等具有至关重要的作用。近年来,随着糖组学研究的兴起,与病毒GP和糖基化相关的研究,受到众多研究者的普遍关注,也已成为当前分子病毒学研究的热点课题。为此,本文从以下两个方面初步研究了包膜糖蛋白多个N-连接糖基化位点突变对汉滩病毒(Hantaanvirus, HTNV)体液与细胞免疫活性的影响。一、HTNV包膜多个N-连接糖基化位点突变型重组假病毒的构建与活性鉴定在前期研究工作的基础上,首先运用一次性多位点同时突变法,对HTNV GP Gn、 Gc编码基因上的5个N-连接糖基化位点(GnN134、N235、N347、 N399和GcN928)同时进行突变,成功构建了5个N-连接糖基化位点的共突变体；采用第三代4质粒慢病毒包装系统成功构建了重组假病毒rLV-M(携带N-连接糖基化位点未突变M基因)、重组假病毒rLV-M'(携带5个N=连接糖基化位点全突变M基因)和重组假病毒rLV(空载体对照)等三种假病毒株,病毒滴度分别为4.0×107TU/ml,2.0×107TU/ml 和 1.0×108TU/ml。二、多个N-连接糖基化位点突变对HTNV包膜糖蛋白免疫学性状影响的研究用9种免疫原：rLV-M、 rLV-M+佐剂、rLV-M'、rLV-M'+佐剂、rLV、rLV+佐剂、佐剂、NS、灭活疫苗以后肢肌肉内多点注射方式,接种C57BL/6小鼠。ELISA法和微量细胞中和试验证实,我们所构建的重组假病毒可诱导C57BL/6小鼠产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,rLV-M免疫组抗HTNV特异性抗体GMT达到1：1386,中和抗体GMT为1：160,rLV-M’免疫组HTNV特异性抗体GMT为1：587,中和抗体GMT为1：113,均显著高于灭活疫苗免疫组的1：269和1：28。在本研究中我们运用ELISPOT法,分别检测了重组假病毒rLV-M和重组假病毒rLV-M'免疫小鼠脾细胞的IFN-γ分泌水平。同时,运用CTL杀伤实验检测免疫小鼠脾细胞对靶细胞的特异性杀伤活性。结果显示,两种方法的检测结果呈明显的正相关,在IFN-γ分泌水平和特异性CTL杀伤活性两个反映细胞免疫功能的检测指标上,灭活疫苗免疫小鼠组均远远的高于重组假病毒rLV-M 与 rLV-M’免疫小鼠组,rLV-M'免疫小鼠组又显著高于rLV-M免疫小鼠组。动物保护试验结果显示,用携带HTNV M基因(无论突变与否)的重组假病毒进行免疫,均可为HTNV感染的小鼠提供一定程度的特异性免疫保护,但这种特异性免疫保护活性的强度远低于商品化灭活疫苗,而rLV-M'对小鼠的特异性免疫保护活性要显著优于rLV-M免疫组。通过本实验,可做出如下推论,5个N-连接糖基化位点的同时突变对HTNV Gn、Gc诱导小鼠产生的抗HTNV特异性抗体和中和抗体的滴度有明显下降,而反映细胞免疫应答水平的各项检测指标,均高于M基因糖基化位点未突变的对照组。显示,多个N-连接糖基化位点的突变,对HTNV GP抗原性和免疫原性的影响,有一定程度的复合与叠加效应,但远不如我们所预期的那样明显。这需要我们在中和性抗原表位与N-连接糖基化位点的空间关系、糖侧链与抗原表位活性等方面做更深入、精细的研究。
【关键词】：汉滩病毒 包膜糖蛋白 N-连接糖基化位点 突变 重组假病毒
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 缩略语8-14
• 第一章 绪论14-28
• 1.1 前言14-15
• 1.2 汉坦病毒的结构与功能15-19
• 1.2.1 汉坦病毒的形态与结构研究15-17
• 1.2.2 汉坦病毒包膜糖蛋白的主要生物学特性17-19
• 1.3 糖蛋白与糖基化19-21
• 1.3.1 蛋白质的糖基化19-20
• 1.3.2 蛋白质的糖基化类型20-21
• 1.4 病毒包膜糖蛋白与糖基化研究21-25
• 1.4.1 病毒糖蛋白糖基化与功能研究21-24
• 1.4.2 汉坦病毒包膜糖蛋白的糖基化研究24-25
• 1.5 重组假病毒技术25-28
• 1.5.1 假病毒的特性和优势25
• 1.5.2 假病毒的制备方法和载体系统25-26
• 1.5.3 重组假病毒技术在病毒学研究中的应用26-28
• 第二章 HTNV包膜糖蛋白多糖基化位点突变型重组假病毒的构建与活性鉴定28-42
• 2.1 材料28-31
• 2.1.1 质粒和菌种28
• 2.1.2 细胞和载体28-29
• 2.1.3 主要试剂29-30
• 2.1.4 培养液30-31
• 2.1.5 常用缓冲液系统与溶液31
• 2.1.6 主要仪器和器材31
• 2.2 实验方法31-35
• 2.2.1 构建多糖基化位点共突变体模板的制备32-34
• 2.2.2 重组HTNV假病毒的包装34-35
• 2.2.3 重组假病毒的培养、扩增及滴度测定35
• 2.2.4 重组假病毒表达产物的鉴定—免疫荧光实验35
• 2.3 实验结果35-39
• 2.3.1 HTNV M基因多糖基化位点的突变结果35-36
• 2.3.2 重组慢病毒表达载体的构建与鉴定结果36-37
• 2.3.3 假病毒颗粒包装结果37-38
• 2.3.4 重组假病毒滴度测定结果38
• 2.3.5 重组假病毒表达产物的间接免疫荧光检测结果38-39
• 2.4 讨论39-42
• 第三章 多糖基化位点突变对HTNV包膜糖蛋白免疫学活性的影响42-60
• 3.1 材料42-43
• 3.1.1 假病毒株42
• 3.1.2 细胞42
• 3.1.3 病毒株42
• 3.1.4 动物42
• 3.1.5 抗体及主要试剂42-43
• 3.1.6 其他常用试剂、缓冲液43
• 3.1.7 主要仪器、设备43
• 3.2 实验方法43-46
• 3.2.1 动物免疫43
• 3.2.2 重组假病毒免疫小鼠血清抗HTNV特异性抗体检测——ELISA间接法43-44
• 3.2.3 重组假病毒免疫小鼠血清中和抗体检测——微量细胞培养中和试验44
• 3.2.4 重组假病毒免疫小鼠细胞因子的检测44-45
• 3.2.5 重组假病毒免疫对HTNV感染小鼠的保护性试验45
• 3.2.6 免疫小鼠脾细胞特异性CTL杀伤活性的检测45-46
• 3.2.7 统计分析46
• 3.3 结果46-53
• 3.3.1 免疫小鼠血清中抗HTNV特异性抗体检测结果46-47
• 3.3.2 免疫小鼠血清中和抗体的检测结果47-48
• 3.3.3 免疫小鼠细胞因子IFN-γ分泌水平的检测结果48-50
• 3.3.4 免疫小鼠的特异性CTL杀伤试验结果50-51
• 3.3.5 重组假病毒免疫对HTNV感染小鼠的保护性试验结果51-53
• 3.4 讨论53-60
• 3.4.1 免疫小鼠体液免疫水平检测结果53-56
• 3.4.2 免疫小鼠细胞免疫水平检测结果56-58
• 3.4.3 重组假病毒免疫对HTNV感染小鼠的保护性试验结果58-60
• 小结60-62
• 参考文献62-77
• 攻读硕士学位期间研究成果77-78
• 致谢78

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 闫克夏;谭文杰;张相民;王慧娟;李岩;阮力;;SARS-CoV假病毒中和试验技术的建立及评价[J];病毒学报;2007年06期

2 马章亮,杭长寿,邱建明,姚树元,宋干;汉滩病毒 A9 株M基因片段在重组痘苗病毒中的表达及鉴定[J];病毒学报;1998年03期

3 田云,卢向阳;糖生物学[J];生物学通报;2002年08期

4 姚智慧,祝晓春,董关木,贺争鸣,俞永新;汉坦病毒76-118株G2基因的克隆及其在甲基营养型酵母中的表达[J];中国生物制品学杂志;2003年01期

5 李琳;郭彦;赵光宇;于虹;孙世惠;潘婷;唐健;周育森;樊卫平;;中东呼吸综合征冠状病毒假病毒系统的建立及其在中和抗体检测中的应用[J];生物技术通讯;2014年02期

6 董关木;肾综合征出血热疫苗研究现状[J];中华实验和临床病毒学杂志;2003年02期

7 王平忠,白雪帆,黄长形;汉滩病毒核衣壳蛋白C-端T细胞表位鉴定[J];中华微生物学和免疫学杂志;2004年05期

8 肖谷田,谢毅,王顺德,林卿,叶韫辉,吴小舟;基因多位点定点突变法机理的探讨[J];自然科学进展;1997年03期

9 张海林;张云智;;中国汉坦病毒基因型及分布[J];中国媒介生物学及控制杂志;2011年05期

10 刘文雪,俞永新,朱智勇,杨立宏,董关木;不同效价出血热灭活疫苗人体接种后的中和抗体应答及其对两个型汉坦病毒的交叉反应[J];中国人兽共患病杂志;2000年01期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 曹海霞;汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白上融合肽的初步确定[D];山东大学;2009年

  本文关键词：汉滩病毒重组假病毒的构建及包膜蛋白糖基化对病毒免疫学性状影响的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：252136