宏基因组测序技术在肠道菌群研究和临床样本检测中的应用

发布时间：2017-03-16 22:00

  本文关键词：宏基因组测序技术在肠道菌群研究和临床样本检测中的应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人体的各个部位定居这大量的微生物,其数目远远超过人体自身的细胞数,约有1x1014之多。这些微生物与人体有着密切的关系,在代谢活动中发挥这不可或缺的作用,同时当某一些微生物出现在相关部位或者其数量,特征发生改变时会影响机体的健康,诱发疾病。其中肠道是微生物定植最多的场所。肠道菌群与人类维持着共生关系,肠道的厌氧环境为菌群提供了生存条件,同时肠道菌群参与了人体的代谢活动,分解食物中的复杂大分子,维生素的合成,结合胆汁酸的生物转化等,完成了许多人体细胞自身不具备的代谢功能。因此,研究人体中的微生物,探究其与人体的相互作用以及微生物与疾病的关系,将微生物学与临床医学相结合,探索出新型的疾病预防控制途径,促进人类健康,具有重大意义。受限于传统的微生物学研究方法主要依赖于微生物的培养和分离鉴定,然而在现有的实验条件下,绝大多数微生物无法通过上述手段获得,因此需要发展出一条不同于传统方法的研究途径。近年来,随着宏基因组测序技术的发展,一些非培养的技术手段在微生物研究中发挥着日益重要的作用。宏基因组测序技术不依赖对样本中微生物群落的培养,直接对样本进行核酸提取,测定样本中所有微生物的核酸序列,这样可避免培养过程中带来的实验污染。宏基因组测序包括16S r DNA和全基因组测序两种手段。16S r DNA测序对细菌的16S r RNA基因进行扩增后测序;全基因组测序不依赖扩增,直接将微生物基因组提取后进行测序。病毒宏基因组学(viral mretagenomics)是在宏基因组学(metagenomics)理论的基础上兴起的一个新的学科的分支,近年来,在病毒病原体(已知或未知)发现与动态监测等方面具有显著的优势。病毒宏基因组学不依赖传统培养方式,直接以样本中所有病毒的遗传物质为研究对象,快速鉴定出样品中所有病毒组成状况。近年来,许多人、动物和植物病毒的发现很大程度上受益于病毒宏基因组学的发展。本文借助宏基因组测序技术,探索了样本中的菌群构成和差异,筛查出临床样本中的病原体。为探索不同环境下肠道菌群构成的变化,我们借助动物模型,提取了不同周龄和饮食状态下小鼠粪便中的细菌核酸,共16组,128份,扩增了16S r DNA的V3V4高变区,之后进行建库测序,分析其中的菌群丰度和构成差异。我们对在一批急性呼吸道疾病病人的咽拭子进行病毒宏基因组测序时,优化了生物信息分析方法,加快了数据分析的速度,发现了Torque teno virus含量的上升,表明急性上呼吸道感染的一些病毒感染含量的变动可作为一些未知的原因的疾病的生物标志物的可能性。核酸提取是宏基因组测序的基础,直接影响到后期建库测序和数据分析的质量。我们利用一株细菌作为实验对象,从基因组DNA的纯度、浓度、完整性、一致性和宏基因组测序结果五个方面评估两种DNA分离试剂盒优化前后四种方法提取巨型球菌基因组DNA的效率,为提取制备困难的巨型球菌基因组DNA的方法选择提供参考,探索宏基因组测序前样本处理的方法。综合以上内容,我们利用宏基因组学技术,对一批小鼠肠道样品、一批急性呼吸道疾病咽拭子样品,探究了不同实验条件下小鼠肠道菌群构成的差异,发现样本中Torque teno virus含量的变化;同时我们针对宏基因组测序的核酸提取这一步进行了方法比较和优化处理。随着宏基因组测序技术的发展,实验方法和后续分析方案的改进和优化,相信宏基因组学将会为微生物学的发展做出更大的贡献。
【关键词】：宏基因组学 16S rDNA 肠道菌群 Torque teno virus 核酸提取
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;R37
【目录】：

• 缩略词表6-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 第一部分 宏基因组测序在肠道菌群研究中的应用15-33
• 第一章 不同处理条件下小鼠肠道菌群构成状况的研究16-24
• 1.引言16
• 2.材料和方法16-20
• 2.1 材料16-18
• 2.1.1 材料来源16-17
• 2.1.2 测序仪器17
• 2.1.3 试剂17-18
• 2.2 方法18-20
• 2.2.1 细菌核酸的 16S rDNA V3 V4区的扩增18
• 2.2.2 构建DNA文库和上机测序18-20
• 3.结果20-23
• 3.1 DNA文库的质量20-21
• 3.2 测序数据概述21
• 3.3 物种丰度分析21-22
• 3.4 肠道菌群构成分析22-23
• 4.讨论23-24
• 第二章 难提取细菌基因组DNA提取方法的比较与优化24-33
• 1.引言24-25
• 2 材料与方法25-28
• 2.1 材料25-26
• 2.1.1 实验菌株25
• 2.1.2 主要试剂（盒）和仪器25-26
• 2.2 方法26-28
• 2.2.1 培养基和培养条件26
• 2.2.2 四种DNA提取方法的比较26
• 2.2.3 细菌DNA浓度检测26
• 2.2.4 细菌DNA纯度检测26-27
• 2.2.5 统计学分析27-28
• 3 结果与分析28-30
• 3.1 四种方法提取DNA浓度和纯度的比较28
• 3.2 不同方法提取DNA完整性分析28-29
• 3.3 宏基因组测序结果分析29-30
• 3.3.1 DNA测序文库质量评估29-30
• 3.3.2 测序结果概述30
• 4 讨论30-33
• 第二部分 宏基因组学在样本检测中的应用33-43
• 1 引言33-34
• 2 材料与方法34-36
• 2.1 样品来源34
• 2.2 核酸提取34
• 2.3 反转录和多重置换扩增（MDA）34-35
• 2.4 文库构建和高通量测序35-36
• 2.5 进化分析36
• 3 结果36-41
• 3.1 测序数据质量36
• 3.2 多株Torque teno virus的发现36-39
• 3.3 高通量测序在病人样本中发现多种类型的噬菌体39-40
• 3.4 咽拭子样本中发现的其他病毒40-41
• 4 讨论41-43
• 参考文献43-53
• 综述 肠道菌群与肥胖及相关代谢性疾病的关系53-61
• 肠道菌群53-54
• 肥胖与肠道菌群54-55
• 肠道菌群的代谢功能55-56
• 肥胖，，慢性炎症和肠道菌群56
• 结论与展望56-58
• 参考文献58-61
• 个人简历61-62
• 致谢62-63

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