人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因工程抗体的研究

发布时间：2019-08-13 16:06

【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)属嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)正嗜肝DNA病毒属,HBV感染严重威胁人类生命健康,可引起急、慢性肝炎、肝衰竭、肝硬化、肝癌以致死亡。全球约有30亿人曾经感染过HBV,将近3.5亿人为慢性HBV感染者。我国1992年和2006年全国HBV感染血清流行病学结果显示,随着乙肝疫苗预防接种纳入新生儿计划免疫后,一般人群的HBsAg阳性率已经明显下降,从92年的9.75%下降到06年的7.18%,使我国由原来的高流行区降为中度流行区,但仍可推算出约9300万乙肝携带者,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者约有2000万例。在《中国病毒性肝炎的流行现状及其相关问题分析报告》中估算出我国每年因慢性乙肝(包括肝硬化、肝癌)的直接和间接医疗费用约6000亿元,给患者和国家造成了巨大的经济负担。乙型肝炎治疗任重而道远,在针对乙型肝炎的治疗药物中,诸如干扰素、胸腺肽α1、核苷类似物、多肽类药物、治疗性疫苗及中草药等,到目前为止,尚未发现能够根除乙肝病毒的药物。目前应用于临床的高效价免疫球蛋白(HBIG)采用健康人即抗-HBsAg阳性的人血制备的,可以中和并清除侵入人体的乙肝病毒,使机体免受乙肝病毒的感染。由于血源来源有限、制备成本高且存在病原体潜在感染的危险,限制了其在临床上的应用。抗体库技术能够筛选出高亲和力的特异性单克隆抗体,从而使大规模生产人源化乙肝抗体成为可能。基于此,本研究中筛选人源抗HBsAg抗体包括以下三部分内容：一、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库的构建和筛选选取5名乙肝表面抗体(HBsAb+)阳性的健康志愿者,接种国产乙肝疫苗进行加强免疫,两周后采集志愿者外周血并分离出淋巴细胞,提取细胞总RNA,使用Oligo dT引物逆转录合成cDNA,利用特异性的8对Lambda轻链子库引物、5对Kappa轻链子库引物和8对重链引物扩增出轻重链Fd片段,轻链和重链分别通过SacⅠ/XbaⅠ和Xhol/SpeⅠ酶切位点克隆到pComb3H载体中,成功电转构建4个Kappa子库和Lambda子库,细菌抗体库鉴定结果表明所构建Fab噬菌体抗体库库容量达到3×108以上,抗体基因插入率接近100%,符合筛库的标准。在成功构建了噬菌体抗体库的基础上,采用辅助噬菌体VCSM13包装成Fab噬菌体抗体库,利用商品化的乙肝表面抗原蛋白对抗体库进行富集筛选。并通过序列测定确定所获各株抗体的基因序列,与v-base database中抗体序列信息进行比较,确定其CDR区。序列测定结果显示共有20株轻重链系列均不相同的克隆株,通过ELISA实验证明这些抗体均为特异性HBsAg抗体,通过竞争性ELISA发现20株抗体可以竞争结合3个不同表位。二、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原全抗体表达及功能鉴定在利用原核细胞XL1-Blue表达Fab抗体的基础上,分别利用哺乳动物瞬时表达系统和杆状病毒-昆虫细胞技术平台实现了全抗体的真核分泌表达。将筛选出的20株抗体中具有高滴度6株Fab抗体的轻链和重链Fd段基因插入杆状病毒载体pAc-L-FcR中,然后将构建完成的重组质粒与杆状病毒重组后转染昆虫细胞,同时将其轻重链可变区基因插入HL51-14哺乳动物细胞表达载体后,转染293T细胞。通过直接免疫荧光检测真核表达效果,收集昆虫细胞和哺乳动物细胞表达上清进行亲和层析纯化。利用SDS-PAGE检测纯化后抗体的纯度、ELISA方法检测纯化后的抗HBsAgIgG全抗体的功能活性,结果表明纯化后的人源HBsAg单克隆抗体抗体纯度达到98%以上,并且具有良好的生物活性。三、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原IgG全抗体亲和力研究将纯化后的抗HBsAg IgG全抗体分别利用非竞争性ELISA方法和BIAcoreSPR检测方法检测其亲和力,结果显示含有同一重链基因的各株抗体的亲和力较高,KD值达到10-9mol/L(abbr.M),而两种表达系统表达的同一株抗体的亲和力活性无明显差异。综上所述,本研究通过基因工程抗体制备技术平台,运用噬菌体表面呈现技术,从乙肝疫苗加强免疫后的HBsAb+志愿者的外周血中获得Fab段抗体基因,成功构建了人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体文库,容量为2×107克隆/ml,轻、重链基因插入率均接近100%。用商品化的乙肝病毒表面抗原对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,经过特异性ELISA、序列测定证实共获得了20株特异性针对乙肝病毒表面抗原的人源Fab单抗,滴度测定后选取6株滴度较高的抗体进行全抗体表达。将重链基因不同的3株Fab抗体的轻链和重链Fd段基因,分别克隆入昆虫细胞全抗体表达载体pAC-L-FcR,转染Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达；将重链相同的的4株Fab抗体轻链和重链可变区基因,分别克隆入哺乳动物全抗体表达载体HL51-14,转染,293T细胞,利用双质粒/哺乳动物细胞表达系统实现全抗体的分泌型表达。通过直接免疫荧光检测表达效果,收集上清进行纯化,共获得6株7种纯度较高的IgG全抗体。利用ELISA对获得的全抗体进行功能鉴定,结果表明7种人源IgG全抗体为特异性的抗乙肝表面抗原抗体,两种表达系统表达的抗体滴度显示293T细胞表达的抗体滴度更高。采用非竞争ELISA方法和BIAcore方法检测亲和力。采用非竞争ELISA固相法,Sf9细胞表达全抗的解离常数分别为1.06×10-8M、2.61×10-9M、2.50×10-10M,293T细胞表达全抗的解离常数分别为1.42×10-10M、1.61×10-10M、1.47×10-10M、3.57×10-10M,CHO-12-5的解离常数为1.93×10-10M。采用BIAcore法,Sf9细胞表达全抗的解离常数分别为5.80×10-8M、1.20×10-6M、5.47×10-9M,293T细胞表达全抗的解离常数分别为3.75×10-9M、9.53×10-9M、7.50×10-9M、7.75×10-9M。结果显示IgG3具有较高的亲和力,两种表达系统未显示出亲和力的差异而两种亲和力检测方法之间,较之ELISA方法的终点定量检测,Biacore法无须标记并且可以实时监测抗原抗体结合的速度、强度、特异性、稳定性和结合量等详细信息,说服力更好更保守。两种亲和力测定方法比较同一株抗体分别采用Sf9细胞稳定表达和293T细胞瞬时表达的差异,发现KD值相差一个数量级,可能是两种方法敏感性不同,有待于的进一步测定。本研究纯化出IgG3人源抗体,如果按优化比例和重组乙肝表面抗原组成抗原抗体复合物,或许会取得较好的治疗效果,亟待进一步实验结果的研究。
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392.1

【参考文献】