卡洛芬单克隆抗体的制备

发布时间：2019-08-13 18:32

【摘要】：目的:制备卡洛芬单克隆抗体,为研制卡洛芬的免疫学快速检测奠定基础。方法:通过活性酯法制备了以牛血清白蛋白(BSA)为载体的免疫抗原卡洛芬-BSA(Carprofen-BSA)和以卵清白蛋白(OVA)为载体的检测抗原卡洛芬-OVA(Carprofen-OVA)。通过免疫BALB/c小鼠、杂交瘤技术获得稳定分泌卡洛芬单抗的细胞株51C3,并通过变异系数及添加回收率的测定初步建立了卡洛芬的ELISA检测方法。结果:将该细胞株注射BALB/c小鼠制备腹水单抗。腹水纯化后效价为1∶3.2×10~5,属于IgG1型。卡洛芬单抗的灵敏度为0.32 ng/ml,IC50为0.882 ng/ml。单抗与布洛芬、酮洛芬、萘普生、非诺洛芬、吲哚洛芬、芬布芬的交叉反应率均小于0.04%。且猪肉样品中卡洛芬的添加回收率在81.4%~104.4%之间,变异系数在16.3%~25.8%之间。结论:本研究成功制备了卡洛芬单克隆抗体,该单抗可以成功应用于卡洛芬的ELISA快速检测,为研制卡洛芬的胶体金快速检测奠定基础。
【图文】：

标准曲线,完全抗原,紫外扫描,图谱

标准品，然后加入4g无水硫酸钠，用玻璃棒搅匀加入15ml乙腈，于漩涡混合器上涡旋1min，4000r/min离心5min，取上清于蒸发瓶中，残渣用15ml乙腈重复提取一次，涡旋1min，4000r/min离心5min，合并两次上清液，加5ml异丙醇，在45℃条件下旋转蒸发仪上蒸干，残渣先加1ml乙腈，超声溶解，然后加3ml乙腈饱和的正己烷，涡旋30s，转移至10ml离心管中，4000r/min离心5min，取上清通过间接竞争ELISA测出OD值，计算抑制率，代入标准曲线回归方程并根据以下公式计算添加回收率:添加回收率(%)=添加值(ng/g)/测定值(ng/g)×100%。图1卡洛芬完全抗原紫外扫描图谱Fig．1UltravioletspectrumofCarprofencompleteanti-gen熊艳华等卡洛芬单克隆抗体的制备第11期·1675·

单抗,偶联,免疫后,效价

fen，BSA和偶联物通过紫外分光光度计在200nm～450nm之间扫描，结果见图1。BSA在280nm处有一特征吸收峰，Carprofen在200nm、240nm和320nm左右有3个吸收峰，其中320nm处的吸收峰可以作为判定的特征吸收峰，从图1A可以看出，Carprofen-BSA的图谱在280nm，320nm处各有一吸收峰，表明Carprofen已经偶联在BSA上了。同理分析Carprofen-OVA的偶联也是成功的(图1B)。2.2免疫过程抗血清效价的监控采用间接ELISA方法，，第1次免疫后，抗体的效价慢慢上升，约30d后抗体的效价维持不变，第2次免疫后，抗体的效价快速升高，结果见图2。2.3抗体的效价根据1.2.7的方法可知卡洛芬-OVA的最适包被浓度为0.2mg/L，用该浓度的抗原包被检测，纯化后的单抗效价为1∶3.2×105结果见表1。按亚类鉴定试剂盒说明书中抗原介导的ELISA法进行鉴定测得卡洛芬51C3细胞分泌的单抗亚类为IgG1型。图2免疫过程中抗体效价监测图Fig．2Antibodytitermonitoringchartinimmuneprocess2.4单抗的灵敏度及标准曲线用PBS将卡洛芬标准品按梯度稀释成0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/ml5个浓度，采用间接竞争ELISA的方法。以卡洛芬的浓度对数为X轴，以B/B0为Y轴拟合标准曲线，结果见图3。线性回归方程为y=－0.4569x+0.4751(Ｒ2=0.9902)。根据1.2.7中的方法，可以计算出卡洛芬单抗的灵敏度为0.32ng/ml，根据线性回归方程计算得出单抗的IC50为0.882ng/ml。2.5交叉反应用卡洛芬的IC50除以其他非甾体类药物的IC50得到交叉反应率，结果见表2。根据结果表明该卡洛芬单抗对表中其他非甾体类的交叉反图3卡洛芬间接竞争ELISA的标准曲线Fig．3CarprofenindirectcompetitiveELISAcurve表251C3单抗与其他非甾体类药物的交叉反应率Tab．2Cross-reactivityofmonocl
【作者单位】：湖北省中西医结合医院;
【分类号】：R392-33

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