Kallistatin蛋白的哺乳动物表达、纯化及单克隆抗体制作初探

发布时间：2017-03-17 12:04

  本文关键词：Kallistatin蛋白的哺乳动物表达、纯化及单克隆抗体制作初探，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人组织激肽释放酶结合蛋白(Kallistatin,Kal),作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,在炎症反应、血管生成以及损伤修复等多种生理和病理过程中发挥着重要的作用。本课题组前期研究表明,Kal具有良好的抗肝纤维化的作用,可以抑制大鼠肝星状细胞的活化,下调星状细胞中的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,并且抑制H202诱导的星状细胞活性氧的形成。同时发现Kal可以作为肝纤维化诊断指标来对肝脏健康状况进行有效检测,并申报国家专利。本研究是在Kal确定可以作为肝纤维化诊断试剂研发基础上的自然延伸,旨在创建一个以Kallistatin为指标的肝纤维化分子诊断ELISA试剂盒。本研究根据国家卫生部关于临床诊断试剂盒制作标准来设计、推进。即当前临床上所用试剂盒除了对抗体进行检测外的试剂盒均为是使用双抗体夹心法,在检测抗体上加入生物素-链霉亲合素系统。本研究首先采用毕赤酵母发酵法和哺乳动物表达获取Kal蛋白。实验结果显示:毕赤酵母表达的Kal蛋白糖基化水平不足,与天然的蛋白质有一定的差异,无法采用。故本研究采用酵母发酵和哺乳动物表达系统获得的Kal蛋白进一步探索。本研究结果显示:通过酵母发酵可获得较高纯度的重组Kal蛋白,使用该蛋白制作抗体时,发现其Kal蛋白免疫原性较差,所以进行免疫时使用40μg/mL的Kal与弗氏佐剂1:1混合后,免疫效果呈现最佳效果。使用脾内免疫与皮下免疫方法对比后发现皮下免疫虽然时间较长,但是效价较高,适合作为单克隆抗体制作的方法。在此基础上,本研究还构建了Kal哺乳动物表达载体,并使用该载体探索在CHO细胞里高效表达,同时进行条件优化。这对于制作一个高灵敏度临床应用的肝纤维化Kal诊断试剂盒提供了参考依据,为临床应用Kal-ELISA试剂盒提供前期基础。
【关键词】：Kallistatin 哺乳动物表达 CHO细胞 单抗 临床应用
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 主要符号对照表9-10
• 第一章 引言10-11
• 第二章 研究目的与意义11-18
• 2.1 Kallistatin概述11-18
• 2.1.1 组织激肽释放酶结合蛋白11-13
• 2.1.2 肝纤维化13-15
• 2.1.3 肝纤维化的诊断15
• 2.1.4 肝纤维化的治疗15-18
• 第三章 Kallistatin蛋白的毕赤酵母表达及纯化18-27
• 3.1 毕赤酵母表达Kal蛋白18-20
• 3.1.1 实验材料18
• 3.1.2 实验试剂18
• 3.1.3 实验仪器18-19
• 3.1.4 试剂配制19
• 3.1.5 实验方法19-20
• 3.2 Kal蛋白的纯化定性及定量20-22
• 3.2.1 试剂配制20-21
• 3.2.2 目的蛋白的纯化21
• 3.2.3 SDA-PAGE电泳检测21-22
• 3.2.4 Western Blot鉴定目的蛋白22
• 3.2.5 BCA法测定总蛋白浓度22
• 3.2.6 Elisa法测定目的蛋白浓度22
• 3.3 统计分析22
• 3.4 实验结果与分析22-27
• 3.4.1 重组人组织激肽释放酶结合蛋白的制备22-24
• 3.4.2 重组人组织激肽释放酶结合蛋白的纯化24
• 3.4.3 SDS-PAGE鉴定24-27
• 第四章 Kallistatin哺乳动物表达载体的构建27-35
• 4.1 实验材料27-28
• 4.1.1 试剂及耗材准备27
• 4.1.2 培养基及溶液的配制27-28
• 4.2 实验方法28-32
• 4.2.1 引物设计28
• 4.2.2 T载的构建与鉴定28-30
• 4.2.3 大肠杆菌的转化及蓝白斑筛选30
• 4.2.4 质粒的小量提取30-31
• 4.2.5 测序31
• 4.2.6 双酶切后的目的片段连接到pcDNA3.1(+)载体31-32
• 4.3 实验结果与分析32-34
• 4.3.1 pcDNA3.1-Kal载的构建与鉴定32-33
• 4.3.2 重组表达质粒的测序结果33-34
• 4.4 讨论34-35
• 第五章 Kallistatin蛋白哺乳动物表达初探35-50
• 5.1 实验材料35
• 5.2 CHO细胞冻存与复苏的条件优化35-36
• 5.1.1 冻存保护液对CHO细胞的影响35
• 5.1.2 冻存条件对CHO细胞的影响35-36
• 5.1.3 复苏方法对CHO细胞存活率的影响36
• 5.3 PEI介导的瞬时转染条件优化36-37
• 5.3.1PEI毒性试验36
• 5.3.2 细胞转染方法36
• 5.3.3 转染条件的优化36-37
• 5.4 结果37-44
• 5.4.1 保存和复苏条件的优化37-40
• 5.4.2 转染条件的优化40-44
• 5.5 讨论44-50
• 5.5.1 宿主细胞的选择45-46
• 5.5.2 表达载体的选择46
• 5.5.3 转染试剂的选择46-48
• 5.5.4 转染过程的优化48
• 5.5.5 质粒的抽提及纯化48-50
• 第六章 Kallistatin蛋白单克隆抗体制作初探50-59
• 6.1 实验材料50
• 6.1.1 实验动物50
• 6.1.2 试剂与器材50
• 6.2 实验方法50-51
• 6.2.1 脾内免疫50
• 6.2.2 皮下免疫50
• 6.2.3 细胞融合50-51
• 6.2.4 血清滴度检测51
• 6.3 实验结果与分析51-53
• 6.3.1 脾内免疫与皮下免疫结果对比51-52
• 6.3.2 抗原使用量及佐剂优化实验52-53
• 6.4 讨论53-59
• 6.4.1 细胞融合前的准备54-55
• 6.4.2 饲养细胞的制备55
• 6.4.3 细胞融合的主要方法55-56
• 6.4.4 杂交瘤细胞的筛选56
• 6.4.5 克隆化技术56-57
• 6.4.6 单克隆杂交瘤细胞的扩大培养57-58
• 6.4.7 无血清培养液在杂交瘤细胞培养中的应用58
• 6.4.8 杂交瘤细胞的冻存和复苏58
• 6.4.9 单抗的效价鉴定及纯化58-59
• 第七章 讨论与展望59-61
• 7.1 毕赤酵母蛋白的表达59
• 7.2 哺乳动物表达59
• 7.3 小鼠抗体制作59
• 7.4 本研究的创新点59-60
• 7.5 未来研究计划60-61
• 参考文献61-65
• 致谢65

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