旋毛虫排泄分泌抗原基因Ts-ES-1的免疫筛选及其重组蛋白诱导小鼠免疫保护性的研究

发布时间：2017-03-17 12:08

  本文关键词：旋毛虫排泄分泌抗原基因Ts-ES-1的免疫筛选及其重组蛋白诱导小鼠免疫保护性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：旋毛虫病是由旋毛形线虫引起的一种食源性人畜共患寄生虫病。人体感染旋毛虫病主要因食入含囊包幼虫的肉类及其制品。旋毛虫病的临床症状复杂多样，病原诊断比较困难，且药物治疗不能解决寄生虫的反复感染。目前仍无有效的旋毛虫病疫苗问世。因此，研制有效的疫苗是旋毛虫病防治中亟待解决的问题。 采用免疫学筛选法从cDNA文库中钓取基因片段，是寻找旋毛虫病疫苗候选抗原分子的有效方法之一，本实验利用人工感染猪血清筛选了旋毛虫成虫cDNA文库。筛选获得的阳性克隆经测序和序列分析后，选取一编码旋毛虫排泄分泌抗原的基因进行克隆表达，并用其重组蛋白免疫BALB/c小鼠，对其免疫学特性及诱导产生的免疫保护性作用开展研究。 首先，本实验用感染猪血清对旋毛虫成虫cDNA文库进行了筛选，通过三轮筛选，获得阳性克隆42个。对筛选结果进行了序列分析。序列分析和GenBank数据库检索结果显示，8-3-4克隆的插入片段全长700bp，，开放阅读框（ORF）为516bp，其编码的蛋白质由172个氨基酸组成，理论分子量19.7kDa。通过软件预测，该蛋白1~21aa为信号肽序列，在体外表达时，应去除信号肽序列，表达22~172aa，共151aa，理论分子量17.3kDa。同源性比较显示，该基因编码的蛋白与旋毛虫一假定蛋白同源性100%，与伪旋毛虫的一个21kDa排泄分泌抗原（excretory/secretory，ES）同源性达79%。综合上述结果，推断此基因编码的蛋白为排泄分泌蛋白，命名为Ts-ES-1。 为获得Ts-ES-1基因编码的蛋白并进一步鉴定其免疫学特性，我们将基因的ORF去除信号肽后（453bp）与原核表达载体pET-28a(+)进行构建并进行蛋白表达。结果显示，经IPTG诱导表达的重组蛋白（rTs-ES-1）分子量约为24kDa（含载体携带的组氨酸标签），与理论值相符。经镍柱亲和层析纯化和复性后，获得纯度较高的rTs-ES-1。 将纯化的rTs-ES-1隔周免疫BALB/c小鼠，免疫三次后，取rTs-ES-1免疫血清。经ELISA鉴定，小鼠体内产生了针对rTs-ES-1的高滴度特异性IgG抗体。Western blot结果显示，病鼠、病猪、病兔以及病人血清均能识别rTs-ES-1，提示rTs-ES-1具有较好的免疫原性和抗原特异性。免疫荧光定位分析证实，Ts-ES-1分布在旋毛虫杆状体的杆状细胞内。通过RT-PCR表明在旋毛虫成虫及肌幼虫体内均有Ts-ES-1基因的转录；Western blot显示，rTs-ES-1免疫血清与旋毛虫肌幼虫和成虫的虫体抗原以及ES抗原均发生反应，在约20kDa处出现识别条带，表明rTs-ES-1既存在于天然虫体抗原中，又存在于旋毛虫的ES抗原中。此结果进一步说明rTs-ES-1是旋毛虫排泄分泌抗原的组分。 其次，为评价rTs-ES-1诱导产生的免疫保护作用，本实验将BALB/c小鼠随机分为三组，用rTs-ES-1与佐剂ISA50V2混合免疫小鼠作为rTs-ES-1免疫组；PBS与佐剂ISA50V2混合免疫及单纯PBS免疫作为对照组；隔周免疫一次，共免疫三次。于末次免疫后2周，每只小鼠经口攻击感染旋毛虫肌幼虫500条。分别在攻虫后5天和攻虫后45天评价成虫减虫率和肌幼虫减虫率，结果显示，与PBS对照组及单纯佐剂组比较，rTs-ES-1免疫组获得了27%的成虫减虫率和42.1%的肌幼虫减虫率（p0.01）。 最后，为探讨rTs-ES-1免疫小鼠诱导产生免疫保护性的机理，本实验用ELISA法对小鼠血清中总IgG和IgG抗体亚型（IgG1、IgG2a）的水平进行了检测，同时利用ELISPOT检测了小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5）的水平。结果显示，与PBS对照组和单纯佐剂组相比，rTs-ES-1免疫组小鼠血清中产生的抗rTs-ES-1特异性抗体IgG和IgG抗体亚型（IgG1、IgG2a）的水平均明显升高（p0.01），其中IgG1较IgG2a升高更为明显。以rTs-ES-1作为刺激物，与PBS对照组及单纯佐剂组相比，rTs-ES-1免疫组小鼠脾细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2及Th2型细胞因子IL-4和IL-5均明显升高。 通过上述实验，我们获得旋毛虫排泄分泌蛋白Ts-ES-1基因及其原核表达的重组蛋白rTs-ES-1。rTs-ES-1免疫小鼠后可诱导产生一定的免疫保护力，成虫和肌幼虫减虫率分别为27%和42.1%。同时，rTs-ES-1可诱导小鼠产生以Th2反应为主的Th1/Th2混合型免疫应答。以上结果表明，rTs-ES-1可作为抗旋毛虫病的疫苗候选抗原分子，为抗旋毛虫病疫苗的研究奠定了基础。
【关键词】：旋毛虫 排泄分泌蛋白 Ts-ES-1 免疫保护性
【学位授予单位】：首都医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R383.15;R392
【目录】：

• 英文缩略词表6-8
• 摘要8-11
• Abstract11-15
• 前言15-18
• 第一部分：旋毛虫排泄分泌蛋白 Ts-ES-1 基因的免疫筛选、克隆表达及免疫学鉴定18-63
• 1. 实验材料18-20
• 2. 主要溶液的配置20-25
• 3. 实验仪器及设备25-27
• 4. 实验流程图27-28
• 5. 实验方法28-48
• 5.1 旋毛虫成虫 cDNA 文库的免疫筛选28-31
• 5.2 阳性克隆的序列测定及分析31
• 5.3 旋毛虫排泄分泌蛋白 Ts-ES-1 基因重组质粒的构建31-37
• 5.4 重组质粒（pET-28a(+)/Ts-ES-1）的诱导表达37-39
• 5.5 重组蛋白 rTs-ES-1 的纯化39-41
• 5.6 重组蛋白 rTs-ES-1 的复性41-42
• 5.7 Western Blot 鉴定42-43
• 5.8 重组蛋白 rTs-ES-1 的免疫学鉴定43-44
• 5.9 Ts-ES-1 在旋毛虫不同发育阶段的基因转录及蛋白表达水平的检测44-46
• 5.10 免疫荧光定位46-48
• 6. 实验结果48-62
• 6.1 旋毛虫成虫 cDNA 文库的免疫筛选及阳性克隆的鉴定48
• 6.2 序列测定及生物信息学分析48-52
• 6.3 重组质粒（pET-28a(+)/Ts-ES-1）的构建52-54
• 6.4 重组质粒（pET-28a(+)/Ts-ES-1）的原核表达54-57
• 6.5 rTs-ES-1 的初步鉴定57-58
• 6.6 rTs-ES-1 的免疫学特性58-59
• 6.7 旋毛虫不同发育阶段 Ts-ES-1 的表达59-60
• 6.8 免疫荧光定位60-62
• 7. 小结62-63
• 第二部分：旋毛虫重组排泄分泌蛋白（rTs-ES-1）免疫小鼠产生免疫保护性及其机制的初步探讨63-81
• 1. 实验材料63-64
• 2. 主要试剂的配制64-66
• 3. 实验仪器及设备66-67
• 4. 实验流程图67-68
• 5. 实验方法68-73
• 5.1 rTs-ES-1 免疫小鼠实验方案68
• 5.2 rTs-ES-1 免疫保护性评价68-69
• 5.3 ELISA 法测定小鼠特异性血清抗体 IgG 效价69-70
• 5.4 ELISPOT 检测小鼠脾细胞分泌细胞因子的淋巴细胞70-72
• 5.5 统计学方法72-73
• 6. 实验结果73-80
• 6.1 重组蛋白 rTs-ES-1 免疫小鼠产生的免疫保护作用73-76
• 6.2 免疫后小鼠体内抗 rTs-ES-1 IgG 抗体效价变化76-77
• 6.3 rTs-ES-1 免疫组小鼠血清 IgG1/IgG2a 抗体亚型分析77
• 6.4 ELISPOT 检测细胞因子的分泌水平77-80
• 7. 小结80-81
• 讨论81-88
• 参考文献88-96
• 文献综述96-114
• 参考文献104-114
• 攻读学位期间发表论文情况114-115
• 致谢115-116
• 个人简历116

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本文编号：252873