抑制PARP-1改善衰老导致的内皮细胞功能紊乱

发布时间：2017-03-17 19:01

  本文关键词：抑制PARP-1改善衰老导致的内皮细胞功能紊乱，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景：大量实验证实衰老导致的内皮细胞功能失调与活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的过度产生和一氧化氮生物利用度降低有关。氧化应激最大的危害是损伤细胞DNA而且还能激活聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP-1)。持续氧化应激引起的DNA损伤可以导致PARP-1的过度激活。近期有实验表明PARP-1参与炎症反应。PARP-1的过度表达提示存在DNA损伤,这与内皮细胞功能失调有着紧密联系,但迄今为止,关于PARP-1和衰老内皮细胞功能联系的研究罕有报道,本研究利用自然衰老的小鼠,探讨抑制PARP-1在保护衰老内皮细胞功能中的作用。研究目的：1.探讨抑制PARP-1对衰老内皮功能的影响2.探讨抑制PARP-1改善内皮细胞功能的机制研究方法：1.动物模型的建立野生型雄性小鼠和PARP-1基因敲除小鼠分别被分成年轻组(2个月)和衰老组(12个月)并测量相关生化指标。2.动物血管功能检测把主动脉切成3mm-4mm的动脉环,每个环都连接到等力测距传感器上。血管环被去甲肾上腺素预先刺激,之后测定对乙酰胆碱和硝普钠的反应。3.实时定量PCR提取主动脉组织RNA并逆转录成cDNA,进行实时定量PCR,测定β-actin,PARP-1, eNOS, iNOS, Arg2的mRNA水平。4.细胞培养以及衰老细胞模型的建立使用AngⅡ刺激人主动脉内皮细胞诱导衰老,使用LY294002, BAY11-7082,和DPQ来抑制Akt,NF-KB and PARP-1的活性。使用β半乳糖甘酶染色来检测衰老模型。5.蛋白印迹提取各组细胞与各组组织的总蛋白,分别检测PARP-1, p-eNOS, eNOS, iNOS, AKT, p-AKT, p16, p21等蛋白的表达量。6.NO水平及ROS水平检测动物血清NO水平使用NO检测试剂盒及分光光度计进行检测和测量。主动脉和细胞ROS水平使用DHE染色试剂盒和DCFH-DA染色试剂盒进行测定。7.免疫荧光使用免疫荧光技术检测NF-kb的核转位情况。8.使用spss12进行数据统计处理,用均数±标准差的形式表示(mean±SD)。研究结果：1.PARP-1在不同年龄的小鼠中的表达变化：在野生型小鼠中,衰老组PARP-1表达水平升高,而PARP-1敲除组中则几乎没有表达。2.衰老组血管功能的改变：野生型衰老小鼠主动脉对乙酰胆碱的敏感性明显下降,而敲除PARP-1的衰老小鼠能明显改善主动脉对乙酰胆碱的敏感性,但是它们对硝普钠的反应却没有统计学意义。3小鼠血NO水平及主动脉组织ROS水平检测：相对于野生型年轻小鼠,野生型衰老小鼠NO水平、ROS水平明显下降,敲除PARP-1后能改善这种变化。4小鼠主动脉组织eNOS, p-enos(Thr454), iNOS及Arg2的蛋白表达：相对于野生型年轻小鼠,野生型衰老小鼠iNOS及Arg2的蛋白表达增高,敲除PARP-1后能改善这种变化,但是eNOS却没有改变。之后测定了p-enos(Thr454)的表达,与野生型年轻小鼠相比,野生型衰老小鼠p-enos(Thr454)的蛋白表达降低,敲除PARP-1后同样也能改善这种变化。5.衰老细胞模型的建立及检测衰老细胞PARP-1的表达：使用AngⅡ诱导主动脉内皮细胞,p半乳糖苷酶和P16 P21检测模型建立,发现AngⅡ诱导的细胞p半乳糖苷酶和P16 P21的表达显著升高,说明模型建立成功。与正常细胞相比,AngⅡ诱导的细胞PARP-1表达升高。6.检测细胞ROS水平和NO水平：AngⅡ诱导的细胞ROS表达增高而上清液NO水平下降。7.AngⅡ通过AKT通道改变PARP-1的表达：同时用AngⅡ和AKT通道抑制剂刺激细胞比单独使用AngⅡ刺激细胞,PARP-1的表达降低程度更明显。8.PARP-1抑制剂和NF-kb抑制剂能减少iNOS的表达增加P-eNOS (Thr454)的表达：与单独使用AngⅡ刺激细胞相比,同时用AngⅡ与PARP-1抑制剂和AngⅡ与NF-kb抑制剂刺激细胞后iNOS的表达明显降低,但是对eNOS的表达没有显著影响,P-eNOS (Thr454)的表达显著升高。9.PARP-1抑制剂通过阻止NF-kb的核转位减少iNOS的表达：免疫荧光显示AngⅡ能诱导NF-kb的核转位,但是加入了 PARP-1抑制剂后能阻止NF-kb核转位的发生。研究结论：1. PARP-1抑制剂能通过调节iNOS的表达来改善衰老引起的内皮细胞功能的失调2.抑制PARP-1的表达也许会成为治疗衰老血管功能失调的新的方向
【关键词】：衰老 内皮细胞功能 一氧化氮合酶 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R339.38
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-15
• 前言15-18
• 材料与方法18-32
• 结果32-37
• 讨论37-43
• 创新点与限制性43-44
• 结论44-45
• 附录45-53
• 参考文献53-59
• 致谢59-60
• 攻读硕士期间撰写与发表的论文60-61
• 附件61

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本文编号：253279