结核分枝杆菌NAD生物合成酶NaMNAT（Rv2421c）的分子伴侣功能

发布时间：2019-08-27 19:08

【摘要】：结核病疫情在世界范围内的急剧恶化已引起全球广泛关注。全球近1/3的人口感染过结核菌。更严重的是对一线药物(异烟肼(Isoniazidum)、利福平(Rifampin)、链霉素(Sstreptomycin)和乙胺丁醇(Eethambatal))甚至二线药物(乙硫异烟胺(Ethionamide)/丙硫异烟胺(Protionamide)、环丝氨酸(Cycloserine)、对氨基水杨酸(P-aminosalicylic acid))的耐受的菌株层出不穷。致使人类的健康水平受到严重的威胁。因此,寻找更有效的药物来治疗这个顽固性疾病是摆在医药工作者面前的重要课题。辅因子的生物合成途径是一个丰富的潜在药物靶标资源库。其中NAD是生物体中广泛存在且必须的辅因子。NAD参与许多氧化还原反应,能量代谢,活细胞代谢调节,蛋白翻译后的修饰,细胞凋亡,DNA修复,端粒的保护,基因沉默,细胞寿命,内分泌调节,免疫应答和钙离子信号通路,NAD还是VB12的合成的前体物等重要的生物过程。我们利用基因组对比分析和子系统注释工具,凭借SEED基因操作平台(http://theseed.uchicago.edu/FIG/index.cgi),重新构建了NAD在生物界中的合成途径。到目前为止主要有六条途径,分别是De novo pathway (Try), NmR pathway (NRK-依赖型),NmR pathway (NRK-非依赖型),Niacin recycling。因此,研究NAD生物合成代谢的关键且保守的酶,并作为开发研制新型的抗结核病的药物靶标具有十分重要的现实意义。其中Mycobacterium tuberculosis拥有的是De novo pathway(Asp)和Niacin salavage两条途径,而NaNMAT, NADS, NADK是存在于M.tuberculosis两条NAD生物合成途径中的三个关键酶,因此是备受关注的潜在药物靶标。本研究主要是对结核分枝杆菌H37Rv的NaNMAT基因nadD (Rv2421c)的克隆、表达及活性研究,并利用生物信息学对该基因编码蛋白进行结构和功能的分析及预测。从GenBank数据库中获得结核分枝杆菌H37Rv的NaNMAT基因nadD的核苷酸序列,设计一对引物,以结核分枝杆菌H37Rv全基因组为模板,体外扩增获得nadD基因。通过TA克隆,将PCR产物连接到pMD19-T Simple Vector,然后亚克隆至载体pET28a(+)中,经菌落PCR、质粒酶切以及序列测定证明成功构建了重组质粒pET28-nadD。将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)对该重组蛋白质诱导表达,Ni+凝胶亲和层析方法纯化获得高纯度的重组NaNMAT。我们还将克隆出来的Rv21c通过构建大肠杆菌和耻垢分枝杆菌之间的穿梭质粒pMV261的重组质粒,来研究过表达该酶对宿主菌的影响,重组NaNMAT耻垢分支杆菌的宿主菌对氧化压力,紫外线照射,酸,碱,SDS, CuSO4等外界压力条件的耐受性均增强。我们在体外利用胰岛素的凝集实验来证实NaNMAT具有分子伴侣的功能,从而解释了其对外界压力的抵抗的基本机理。证明NaNMAT作为分子伴侣对细菌生存的影响。我们还利用生物信息学对结核分枝杆菌的NaNMAT进行预测研究,结果揭示了NaNMAT是pI为5.16,没有跨膜结构的定位在细胞质内蛋白,而且其在进化中是与人类和果蝇NNMAT的距离较远的蛋白,氨基酸的一级结构分析也说明了他们的差别很大。
【图文】：

亚细胞定位,同工酶,催化反应,底物

西南大学硕士学位论文综述类与蛋白质的不稳定构象相结合并使之稳定。它在蛋白质复性过程中主要起2个作用:(l)帮助变性蛋白质完成正确的折叠;(2)在ATP的存在下负责对正在复性或复性好的蛋白质进行监控，防止蛋白质错误折叠l30]。1.3NaMNAT的基本概述1.3.1NMN加aMNAT催化的反应和其结构特征此酶可催化NaMN(NMN)形成NaAD(NAD)(如图2)，根据此酶对底物的偏好性不同，可以将其分为两类(1.)NaMNAT(EC:2.7.718):表现出对NaMN而不是咖N作为底物的强烈偏好型，主要存在于真细菌，(2.)NMNAT(EC:2.7.1.1):表现出NMN/NaMNAT两方面催化活性，而不是显著区分NMN和NaMN作为底物，主要存在于真核生物和古细菌的(如图2)。

蛋白质相对分子质量,结核分枝杆菌,硕士学位论文,理化性质

西南大学硕士学位论文结果与讨论第四章结果与讨论4.1结核分枝杆菌H37RvNaMNAT的理化性质利用ProtParam分析NaMNAT(EC=2.7.7.18)基因显示该蛋白质相对分子质量为23.053动a，理论等电点(pl)为5.16，推测分子式为Clo23H15s5N2810川58;不稳定系数(instabilityindex，11)为36.79，表明此蛋白性质稳定。使用protscale(http://www.expasy.or弥91一bin/protseale.pl)进行疏水性分析，该软件采用的是Hphob了Kyte&Doolittle算法。平均疏水性分析显示约有4个峰值，分布于氨基酸残基20一35，，50一60，100一110，130一170区域(见图8)。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R378

【共引文献】