G蛋白偶联受体激酶6同源二聚化的机制及其对胞膜定位的影响

发布时间：2017-03-17 20:05

  本文关键词：G蛋白偶联受体激酶6同源二聚化的机制及其对胞膜定位的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinases,GRKS)通过特异性地磷酸化配体激活的G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors,GPCRS),快速“关闭”或“减敏(desensitization)”激动剂持续引发的信号传导,从而调控GPCR介导的各种生理病理活动。GRK6属于GRK4亚家族成员,在调节细胞功能代谢以及神经元退行性变中发挥重要作用。GRK6晶体结构显示,在氨基端区的G蛋白信号调节子(RGS)结构域中存在一个由Ile39、Met165、Tyr166和Phe527 4个疏水性氨基酸组成的同源二聚化作用界面,人工突变这些氨基酸残基导致GRK6蛋白的激酶活性显著降低。因此,二聚化可能是GRK6调控GPCR的重要机制之一。迄今为止,还未有GRK在细胞内形成二聚体的报道。另一方面,定位细胞膜是GRK调控GPCR信号通路的前提条件,而GRK6分子同源二聚化对其胞膜定位的影响目前还不清楚。本研究旨在揭示GRK6在细胞内同源二聚化的现象与机制、及其对GRK6胞膜定位的影响。方法:首先,本实验采用竞争性双分子荧光互补(BiFC-C)方法,在共转染融合质粒pBiFC-GRK6-VN173/pBiFC-GRK6-VC155基础上加入GRK6-mCherry及pmCherry-N1至HEK293细胞中,检测BiFC荧光信号改变。联合荧光共振能量转移(FRET)技术,将融合质粒GRK6-GFP/GRK6-mCherry与对照组Gi(1-10)-GFP/GRK6-mCherry分别共转染入HEK293细胞中,在激光共聚焦扫描显微镜下以受体光漂白法分析GRK6分子的FRET效率,观察GRK6的同源二聚化现象。其次,人工突变GRK6的Met165、Tyr166和Phe527三个氨基酸残基,构建GRK6二聚化界面突变子(GRK6EED)BiFC和FRET质粒,检测突变体与野生型GRK6的BiFC荧光信号及FRET效率的改变,评判其是否为GRK6的同源二聚化界面的关键基团。最后,在荧光显微镜下观察突变体与野生型GRK6分子的胞膜定位。结果:在GRK6-VN173+GRK6-VC155共表达组检测到显著的BiFC阳性信号;其阳性信号的细胞数量和BiFC信号强度可被GRK6-mCherry竞争分子显著抑制。在GRK6-GFP与GRK6-mCherry分子之间检测到显著的FRET信号;转染突变质粒组的BiFC信号阳性细胞数和信号强度均显著低于野生型GRK6;突变体的FRET信号较野生型对照组显著降低。最后,Met165、Tyr166和Phe527突变的GRK6分子失去胞膜定位能力,主要分布于胞浆。结论:研究结果表明,GRK6在细胞内能够形成同源二聚体,Met165、Tyr166和Phe527可能是GRK6分子同源二聚化作用界面的关键基团,并对GRK6的胞膜定位起重要作用。本研究为证实GRK6在细胞内发生同源二聚化提供了直接证据,为深入研究GRK6的亚细胞分布调控机制提供了新线索。
【关键词】：GRK6 同源二聚化 胞膜定位 信号转导
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3416
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 英汉缩略词对照表8-10
• 前言10-11
• 1 材料与方法11-30
• 1.1 主要实验试剂与仪器11-19
• 1.2 方法19-30
• 2 结果30-38
• 3 讨论38-41
• 4 结论41-42
• 参考文献42-44
• 附录（综述）44-52
• 参考文献50-52
• 攻读学位期间发表的学术论文目录52-53
• 致谢53

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本文编号：253381