实现黏附因子FimH在幽门螺杆菌中外膜展示

发布时间：2017-03-18 00:01

  本文关键词：实现黏附因子FimH在幽门螺杆菌中外膜展示，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：幽门螺杆菌是一种致病菌,能够在胃粘膜长期定植,导致胃炎、胃溃疡甚至胃癌等严重胃部疾病,世界卫生组织已经将其列为Ⅰ类致癌原。幽门螺杆菌在世界范围内感染率高达50%以上,传统的药物治疗方法由于费用、副作用及耐药株的出现而受到限制。开发疫苗用于预防或治疗幽门螺杆菌具有重大意义,而现有的各种动物评价系统存在一定缺陷,使用最广泛的小鼠感染模型存在定植不稳定的现象。本课题旨在通过基因敲入技术将外源黏附因子一一鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ型菌毛黏附蛋白FimH或其黏附结构域导入幽门螺杆菌基因组中,实现外源黏附因子与幽门螺杆菌自身外膜蛋白Lpp20和Omp18融合表达并在外膜展示,以增强幽门螺杆菌在小鼠胃肠黏膜中的定植能力。在实验的第一部分中,我们对幽门螺杆菌的基因打靶技术进行了优化。从培养基、抗生素、感受态浓度、孵育时间及同源臂长度对基因打靶系统进行了细致的考察。通过比较发现：在含血清的培养基中幽门螺杆菌生长旺盛,相对于全血培养基能够缩短打靶周期；在抗生素选择压力方面,卡那霉素相对于氯霉素更能够避免假阳性的出现：感受态细菌浓度在2×109cfu/ml以上时能够得到转化子,但在2×1010cfu/ml时,可以成功获得更多的转化子：电击后孵育时间为24h时,转化效率较高；在300-700bp考察范围之内的同源臂长度对于基因敲除转化效率影响不显著。通过大量实验发现,二次转涂可以极大地提高转化率,使打靶重组子更容易获得。构建了四种基因敲入的打靶载体p-Lpp20-FimH、p-Lpp20-FimH(Ld)、 p-Omp18-FimH及p-Omp18-FimH(Ld),利用基因敲入技术将其导入到幽门螺杆菌26695中,使fimH基因或其黏附结构域基因片段fimH(ld)与幽门螺杆菌外膜蛋白基因lpp20或omp18融合表达。利用交叉引物对其进行基因组水平上的验证,证明外源基因imH或fimH(ld)已经整合在幽门螺杆菌26695基因组指定位置：在转录水平上,利用RT-PCR技术对fimH或fimH(ld)的转录进行了验证,证明了lpp20-fimH, lpp20-fimH(ld), ompl8-fimH, ompl8-fimH(ld)融合基因转录产物的存在。将fimH基因表达在大肠杆菌中,获得了FimH重组蛋白。对FimH重组包涵体蛋白进行洗涤纯化后,免疫新西兰大耳白兔,获得了针对FimH的多克隆抗体,抗体效价为1：10000。通过超速离心的方法提取了幽门螺杆菌26695四个重组菌株的外膜蛋白,利用Western Blot检测外膜蛋白中FimH的表达。结果证明可以在重组菌株HP-Lpp20-FimH、HP-Lpp20-FimH(Ld)的外膜蛋白中检测到融合蛋白Lpp20-FimH、Lpp20-FimH(Ld)的表达。利用斑点杂交检测外膜蛋白,结果证明重组菌株HP-Lpp20-FimHvHP-Lpp20-FimH(Ld)、Omp18-FimH、 Omp18-Fim(1d)外膜蛋白具有FimH的与甘露糖结合活性。
【关键词】：幽门螺杆菌 基因打靶 外膜展示 黏附
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-18
• 第一章 绪论18-28
• 1.1 幽门螺杆菌疫苗现状19-21
• 1.1.1 幽门螺杆菌全菌疫苗19
• 1.1.2 幽门螺杆菌亚单位疫苗19-20
• 1.1.3 核酸疫苗20
• 1.1.4 活载体疫苗20
• 1.1.5 佐剂20-21
• 1.1.6 给药方式21
• 1.2 幽门螺杆菌疫苗评价的动物模型21-23
• 1.2.1 灵长类动物模型21-22
• 1.2.2 其他大型哺乳动物模型22
• 1.2.3 大鼠模型22
• 1.2.4 小鼠模型22
• 1.2.5 蒙古沙鼠模型22-23
• 1.2.6 转基因小鼠23
• 1.3 幽门螺杆菌的黏附因子23
• 1.4 外源黏附因子23-25
• 1.5 幽门螺杆菌基因打靶25-26
• 1.6 表面展示系统26
• 1.7 幽门螺杆菌外膜蛋白26-27
• 1.7.1 Lpp2026
• 1.7.2 Omp1826-27
• 1.8 立题依据27-28
• 第二章 幽门螺杆菌基因打靶优化28-44
• 2.1 实验材料28-29
• 2.1.1 质粒和菌株28
• 2.1.2 酶与试剂28-29
• 2.1.3 培养基及溶液29
• 2.2 实验方法29-33
• 2.2.1 幽门螺杆菌的培养29-30
• 2.2.2 幽门螺杆菌基因组的制备30
• 2.2.3 引物序列设计30
• 2.2.4 PCR扩增目的基因30-31
• 2.2.5 打靶载体的构建31-32
• 2.2.6 感受态的制备32
• 2.2.7 抗生素的选择32
• 2.2.8 二次转涂影响32
• 2.2.9 感受态浓度的影响32-33
• 2.2.10 孵育时间影响33
• 2.2.11 同源臂长度影响33
• 2.3 实验结果33-41
• 2.3.1 幽门螺杆菌基因敲除技术路线33-34
• 2.3.2 同源臂的扩增34-35
• 2.3.3 打靶载体的构建35-36
• 2.3.4 抗生素的选择36
• 2.3.5 二次转涂的影响36-38
• 2.3.6 感受态浓度影响38-39
• 2.3.7 孵育时间影响39-40
• 2.3.8 同源臂长度的影响40-41
• 2.4 讨论41-44
• 第三章 幽门螺杆菌基改造菌株的构建及鉴定44-68
• 3.1 实验材料44-45
• 3.1.1 质粒与菌株44-45
• 3.1.2 酶与试剂45
• 3.2 试验方法45-53
• 3.2.1 幽门螺杆菌的培养45-46
• 3.2.2 幽门螺杆菌基因组模板的制备46
• 3.2.3 S. typhimurium基因组的制备46
• 3.2.4 引物序列设计46-47
• 3.2.5 打靶载体构建47-48
• 3.2.6 基因敲入48
• 3.2.7 基因组水平验证48-49
• 3.2.8 RNA水平验证49-51
• 3.2.9 FimH重组表达51-52
• 3.2.10 FimH多抗制备52
• 3.2.11 外膜蛋白提取52
• 3.2.12 外膜蛋白Western Blot52
• 3.2.13 外膜蛋白斑点杂交52-53
• 3.3 实验结果53-64
• 3.3.1 技术路线53
• 3.3.2 基因敲入示意图53-54
• 3.3.3 打靶载体片段扩增54-55
• 3.3.4 打靶载体构建55-57
• 3.3.5 基因组水平验证57-59
• 3.3.6 RNA水平验证59-62
• 3.3.7 FimH重组表达62
• 3.3.8 FimH多抗的制备62-63
• 3.3.9 Western Blot63-64
• 3.3.10 斑点杂交64
• 3.4 讨论64-68
• 第四章 结论68-69
• 参考文献69-75
• 致谢75-76
• 作者攻读学位期间发表的学术论文76-77
• 作者和导师简介77-79
• 附件79-80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 吴小茜,余菲菲;幽门螺杆菌疫苗的研究现状及展望[J];福建医科大学学报;2005年S1期

2 岳俊杰;李北平;周围;高原;王月兰;梁龙;;幽门螺杆菌Lpp20蛋白的生物信息学分析[J];生物技术通讯;2009年05期

3 邹全明;;幽门螺杆菌疫苗的研究进展[J];胃肠病学;2007年09期

4 凌峰;王晓春;陈s

本文编号：253607