中枢神经系统感染病原体MLPA诊断试剂盒初步研发

发布时间：2017-03-18 08:06

  本文关键词：中枢神经系统感染病原体MLPA诊断试剂盒初步研发，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：神经中枢系统(Central Nervous System,CNS)感染是临床上常见疾病,由于其高致死率和产生严重后遗症而倍受关注。快速明确诊断是应对临床治疗非常关键,但是,现有诊断技术不能达到此目的。本课题先总结了常见CNS感染病原物种类,接着针对神经外科手术感染(Intracranial infection)17种常见细菌设计了一套MLPA探针。由于构建MLPA探针所需质粒等关键试剂一直被荷兰MRC-Holland公司垄断,除了利用合成方法制备短探针外,我们不得不逐步探索一套MLPA长探针制备方法。首先我们使用M13噬菌体克隆了17种致病细菌的MLPA长探针,并把所得的M13噬菌体载体均通过了测序验证以保证这17个克隆载体均能够用于制备MLPA探针,再通过Bsm I和Eco R V双酶切法制备获得长探针。该种探针制备方法使MLPA探针扩大化生产变得简单、快速,可以推广到其他MLPA探针大量制备工艺中。在探针验证方面,我们克隆了17个阳性标准品质粒,这些质粒各含有短探针和长探针DNA序列,经过单靶点和多靶点PCR扩增、ABI3500毛细电泳测试分析,证明我们制备的MLPA探针具备非常高的灵敏度和靶向性。课题预计仅用1 ml M13噬菌体衍生载体液体制备的探针便可满足10万次左右的MLPA反应,凸显了MLPA的廉价性,也说明了MLPA诊断技术用于CNS感染病原体诊断有市场潜力。课题也做了探针质量控制分析,为进一步将探针研发成可以商品化的诊断试剂盒奠定了基础。总之,所设计的MLPA试剂盒具有灵敏度高、快速、操作简单、便宜等优点,对CNS感染病原菌诊断具有重要医用潜力。本课题也同时设计了针对脑炎(Encephalitis)、脑膜炎(Cephalomeningitis)等非神经外科手术(Craniotomy)后感染的病原体MLPA诊断探针。首先,为体现探针的可靠性和科学性我们争取每一个靶位点找到相关的研究文献数据,其次,联合使用Raw probe、MLPA Probe Verification和The mfold Web Server等生物信息学手段组装探针和控制探针质量参数,最终得到的探针均达到MRC-Holland公司提出的MLPA探针设计标准。但是研究生学习时间紧迫未能进行探针克隆等相关试剂盒研发。
【关键词】：中枢神经感染 致病微生物 诊断试剂盒 MLPA 探针制备 M13噬菌体质粒
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第1章 引言10-22
• 1.1 CNS感染简介10
• 1.2 CNS感染病原学特征简介10-17
• 1.2.1 病毒性脑炎及流行病学特征11-13
• 1.2.2 细菌感染病原学特征及ICI病原学简介13-16
• 1.2.3 其他病原体16-17
• 1.3 CNS感染诊断方法17-18
• 1.3.1 CNS感染病原体传统诊断方法17-18
• 1.3.2 分子检测技术18
• 1.4 研究方案简介18-21
• 1.4.1 MLPA技术简介18-19
• 1.4.2 MLPA技术原理19-20
• 1.4.3 MLPA技术特点20-21
• 1.4.4 MLPA技术应用21
• 1.5 课题研究内容和意义21-22
• 第2章 第CNS感染病原体MLPA探针设计22-28
• 2.1 实验工具和设计原则22-23
• 2.1.1 探针设计需要的软件和资料22-23
• 2.1.2 MLPA探针设计基本原则和需要注意的关键部分23
• 2.2 MLPA探针设计步骤和流程23-24
• 2.3 实验结果与分析24-28
• 2.3.1 CNS病原体及其靶序列24-27
• 2.3.2 CNS设计探针27-28
• 第3章 ICI原体感染MLPA探针分子克隆28-61
• 3.1 实验耗材、试剂及仪器29-33
• 3.1.1 实验材料29
• 3.1.2 化学试剂及耗材29-31
• 3.1.4 实验仪器31-32
• 3.1.5 常用试剂配制32-33
• 3.2 实验方法及步骤33-42
• 3.2.1 雄性大肠杆菌JM109筛选与宿主菌制备33-34
• 3.2.2 蓝白斑筛选法获得重组M13噬菌体与悬浊液制备34-40
• 3.2.3 重组噬菌体液体培养与原种制备40
• 3.2.4 M13-dsDNA制备与测序验证40-42
• 3.3 实验结果与分析42-57
• 3.3.1 雄性大肠杆菌JM109筛选与宿主菌制备42-43
• 3.3.2 蓝白斑筛选法获得重组M13噬菌体与悬浊液制备P C R结 果与分析 .. 343.3.3 双链D N A制 备P C R结 果验证与送测序分析43-57
• 3.4 讨论57-59
• 3.4.1 宿主菌对实验实验影响57-58
• 3.4.2 蓝白斑筛选阳性克隆与悬浊液制备58-59
• 3.4.3 重组噬菌体测序验证59
• 3.5 本章小结59-61
• 第4章 MLPA技术诊断神经外科病原体方法学建立61-89
• 4.1 实验耗材、试剂及仪器61-63
• 4.1.1 实验材料61
• 4.1.2 化学试剂及耗材61-62
• 4.1.3 实验仪器62-63
• 4.1.4 常用试剂配制63
• 4.2 实验方法及步骤63-72
• 4.2.1 重组M13噬菌体单链DNA制备63-64
• 4.2.2 MLPA探针的制备64-67
• 4.2.3 MLPA探针诊断病原体方法学初步探究67-71
• 4.2.4 部分探针质量初步验证71-72
• 4.3 实验结果与分析72-86
• 4.3.1 制备探针的单链DNA制备结果与分析72-73
• 4.3.2 MLPA方法学诊断结果与分析73-83
• 4.3.3 部分探针质量验证结果与分析83-86
• 4.4 讨论86-87
• 4.5 本章小结87-89
• 第5章 结论89-91
• 5.1 文章研究成果小结89
• 5.2 需要进一步完善工作89-91
• 参考文献91-101
• 致谢101-103
• 附件A103-111
• 附件B111-121
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究结果121

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 茆海丰;刘洪书;赵勇;营丽娟;;医院感染的金黄色葡萄球菌耐药性与耐药基因检测[J];中华医院感染学杂志;2007年07期

2 张星虎;;中枢神经系统感染的病原学诊断[J];中国神经免疫学和神经病学杂志;2011年06期

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本文编号：254153