结肠炎患者HCMV感染的临床分析及MCMV感染同种异型皮肤移植小鼠急性结肠炎模型的建立

发布时间：2019-10-14 11:48

【摘要】：目的:采用小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)感染同种异型皮肤移植小鼠,建立MCMV感染急性结肠炎症模型,从而为研究HCMV结肠炎致病机制和临床诊断和治疗提供可靠的动物模型。 方法:第一部分:临床资料: 2011年1月～2011年4月期间在从安徽中医学院内镜中心收集36份接受肠镜检查后确诊为急性结肠炎的标本,男23例,女13例,年龄分布为45～82岁,钳取的标本为损伤部位的边缘部位,按实验设计分别做HCMV感染的实验室检测:(1)HCMV病毒分离,将标本研磨离心后取上清接种至人胚肺成纤维细胞(HELF)上,逐日观察细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),并对病变的细胞进行pp65抗原间接免疫荧光( IFA,indirect immunofluorescence)染色;(2)采用PCR检测标本中HCMV IE基因,记录分析结果,初步确定急性结肠炎患者中HCMV的感染率及感染状态。 第二部分:动物模型的建立:采用鼻腔接种的方式感染同种异型皮肤移植的小鼠。①供体:C57BL/6雌鼠,18只;受体:BALB/c雌鼠,72只,鼠龄4～6周,体重14～20g/只;将C57BL/6小鼠的背部大小约(1.0cm×1.0cm)皮片移植到BALB/c小鼠背部的移植床上,术后给BALB/c小鼠腹腔注射环孢素连续2周(15mg/kg.d)。②将移植后小鼠随机分为3组,其中感染组分为两组,按接种病毒接种剂量分为104PFU组和105PFU组,同时设立一组阴性对照组,即鼻腔接种细胞悬液,每组24只。每日观察动物体重等一般情况及排便情况;分别于病毒接种后第5、9、14和第21d取得小鼠结肠组织,通过病毒分离、HE染色、透射电镜、MCMV M55基因RT-PCR、原位杂交以及pp65抗原免疫组化的方法,观察检测小鼠结肠组织中MCMV与其组织病理变化之间的关联性。 结果:(1)通过对所收集的患者结肠标本进行HCMV IE基因PCR、病毒分离和pp65抗原间接免疫荧光检测,发现几乎所有患者的结肠组织中均有HCMV感染,阳性率可高达91.67%;标本在盲传3代后,细胞出现CPE,且HCMV IE基因PCR有阳性条带出现,通过统计分析:收集标本分离阳性率为36.1%。对病毒分离阳性的样本进行pp65抗原间接免疫荧光检测,发现有苹果绿色的阳性信号出现,说明HCMV处于复制增殖的状态。 (2)对三组小鼠进行生存状况观察发现,感染过程中105PFU组小鼠出现厌食、嗜睡、活动能力明显下降,并且发现该组小鼠的体重明显减轻(p0.01)。在对三组小鼠结肠组织病理观察发现,感染第14d,感染组小鼠的近端结肠组织粘膜层变薄,同时其结构也被破坏;感染组小鼠的远端结肠组织也均出现淋巴样滤泡和粘膜层结构异常,其中105PFU组小鼠的结肠粘膜层结构紊乱,并出现大面积炎性细胞浸润;肠道组织通过病毒分离后,发现MEF上出现典型的CPE;透射电镜观察可见疱疹样病毒颗粒;原位杂交结果显示结肠组织中MCMV IE1基因阳性,MCMV M55基因RT-PCR检测结果为阳性; pp65抗原免疫组化检验结果为MCMV pp65蛋白阳性。而阴性对照组上述检测指标均为阴性。 结论:(1)HCMV感染普遍存在于急性结肠炎患者肠道组织中,且阳性率为91.67%。但该病毒的活动性感染率也高达36.1%。这些证据初步表明:HCMV活动性感染可能与该病的发生发展和结局密切相关,这为急性结肠炎的临床诊断治疗提供了新思路。尤其在激素治疗无效的急性结肠炎患者中,应及时采用抗病毒治疗。(2)通过对同种异型皮肤移植后小鼠鼻腔接种MCMV,首次成功建立MCMV感染同种异型皮肤移植小鼠急性结肠炎模型,小鼠结肠发生了类似人类结肠炎症的病理变化。该模型为进一步研究HCMV结肠炎的发病机理及药物干预建立一个极为重要的平台,同时也为临床上研究进一步治疗人类病毒相关性结肠炎症提供了重要动物模型。
【图文】：

图 1 患者结肠组织标本 HCMV IE 基因 PCR 检测Fig1 Detection of HCMV IE gene PCR in colitis patient泳道 M：DL2000 DNA Marker Lane M: DL2000 DNAMarker泳道 1：阳性对照 Lane 1: positive control泳道 2：阴性对照 Lane 2: negative control泳道 3-16：患者结肠标本 Lane 3-16: colon samples in patients分离对所有的标本进行病毒分离，在盲传 3 代后，在细胞培养因此说明病毒是处于活动性感染状态的；进行 HCMV IE 标本中出现条带的位置和阳性对照是一致的（见图 3）。p示，在细胞核内和胞浆中均发现有苹果绿色的阳性信号出

肠标本中 HCMV 在 HELF 上的 CPE（未染色，，×LF infection with HCMV of colon samples（uns: 正常 HELF 细胞 B: HCMV 感染后的 HELF A: normal HELF B: HELF infection with HB
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R574.62;R-332

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本文编号：2549242