人博卡病毒结构蛋白与非结构蛋白功能的初步研究

发布时间：2019-10-15 16:32

【摘要】：2005年科学家Allander利用PCR技术,通过借助信息学相关方法对婴幼儿鼻咽分泌物样本进行大范围排查,发现了一类新型细小病毒,即人博卡病毒(HumanBocavirus, HBoV)。 HBoV是一种直径约为18-25nm,无囊膜,单链线性DNA病毒,基因组大小约为5300nt,其外包被着T=1的二十面体的蛋白衣壳,以保护DNA不受外界环境如高温、PH变化、高盐等影响。感染HBoV的患者外表症状多为发烧、咳嗽、喘息等下呼吸道感染症状,少数病情严重者出现呼吸窘迫的现象。HBoV属于细小病毒科,细小病毒亚科,博卡病毒属。 HBoV基因组含有两个主要开放阅读框,一个编码非结构蛋白NS1和NP1,另一个则转录翻译两个衣壳蛋白VP1和VP2; VP1的5’端独特区VP1-Unique序列具有磷脂酶A2活性,这种活性与病毒的感染性有关,已有的一些资料表明,基因组中编码非结构蛋白的区域比较保守,而变化的部分位于编码核衣壳蛋白的区域；在基因组DNA的3’端和5’端分别存在一个末端反向重复序列(Inverted terminal repeat, ITR),其会形成反转回文结构,细小病毒DNA复制时是以该末端两部分反转互补的回折部分作为的引物。 本研究依据人博卡病毒基因序列(GeneBank:GU139423)设计VP1抗原表位区域(4160-4480nt)的引物,通过PCR技术扩增目的基因,并将扩增的片段插入到质粒pET-49b (+)中,通过IPTG诱导融合蛋白,并用切胶纯化的方法切取融合蛋白,研磨并用PBS溶解,之后将制备的融合蛋白样免疫小鼠,最终得到VP1多克隆抗体,为今后研究人博卡病毒结构蛋白VP1和VP2的功能奠定了坚实的基础。 同时,为了弄清楚人博卡病毒VP1、VP2以及NS1蛋白在细胞中的分布情况,本实验还将这几个蛋白的基因分别克隆到真核表达载体pEGFP系列上,并将重组质粒转入哺乳动物细胞293T细胞中,观察VP1、VP2以及NS1蛋白在细胞中的定位分布。然而,在研究蛋白定位的同时,本实验发现将pEGFP-n1-NP重组质粒转染进入HeLa细胞后,细胞出现了明显的凋亡的现象,并且在之后利用DAPI染色与Capsase活性检测等实验对这一现象做了进一步的确认。
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R373

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本文编号：2549726