截短侧耳素高产菌株重离子诱变及高通量筛选

发布时间：2019-10-23 01:10

【摘要】：截短侧耳素（pleuromutilin）是由高等真菌担子菌Clitopilus passeckerianus产生的一种二萜烯类抗生素，对青霉素-链霉素抗性葡萄球菌具有抑制作用。以截短侧耳素为起点人工合成的一系列截短侧耳素类抗生素具有优越的抗菌活性，人们认为它是对抗耐药菌的有力武器，，极具研究价值，许多新型的截短侧耳素类抗生素正处在研发上市的各个阶段，因此截短侧耳素类抗生素的国内外需求量不断增大。原料药截短侧耳素的产量制约着截短侧耳素类抗生素发展，因此本研究对截短侧耳素产生菌进行了高产菌株的诱变选育。选育高产菌株，必须考虑的因素有三个，诱变方法、发酵优化、筛选方法。前人使用了多种诱变方法选育截短侧耳素高产菌株，但Clitopilus passeckerianus为高等真菌，修复能力强，一般诱变剂不能对其达到良好的诱变作用。优化截短侧耳素发酵条件，前人多采用单因子试验或者正交试验，试验次数多，且无法找到最佳因素水平组合。截短侧耳素产生菌筛选耗时长，工作量大，是阻碍其应用发展的重要因素，急待建立快速筛选方法。基于以上原因，本研究的主要方法与结果如下： 1.重离子辐照诱变截短侧耳素产生菌兰州近代物理研究所重离子加速器产生的重离子束由于能量大，诱变作用强，突变不易修复的特点，越来越多的应用于微生物的诱变，并取得了良好的效果。本研究首次利用重离子辐照对截短侧耳素产生菌进行诱变，并筛选高产菌株。得到了碳离子诱变Clitopilus passeckerianus的最适诱变方式和最适剂量为离子注入辐照40Gy，为进一步利用碳离子辐照诱变Clitopilus passeckerianus提供了一定的理论依据，并筛选出一株截短侧耳素高产菌株K40-3，摇瓶效价达到16120μg/mL，较出发菌株提高25.3%。 2.截短侧耳素产生菌发酵条件的响应面法优化本研究利用响应面法对碳离子辐照诱变后筛选得到的高产菌株K40-3进行了摇瓶发酵条件优化，并借助于SAS软件进行试验设计与数据分析，得到的最佳发酵条件为葡萄糖5.0%、大豆油0.33%、酵母粉0.6%、玉米浆3.0%、MgSO_40.035%、CaCO_30.05%、初始pH6.9、装量35mL/500mL△，截短侧耳素效价达到24750μg/mL，在初始发酵条件的基础上提高了53.7%。 3.高通量截短侧耳素产生菌筛选方法的建立近年来发展起来的高通量技术，由于具有微型化、高效化、低廉化的各种特点，非常适合应用于高产菌株的筛选。前人在高通量筛选菌株的研究中已做了大量的工作，建立了多种工业微生物微量培养和高通量产物检测方法，但并没有适合于Clitopiluspasseckerianus的微量培养方法与产物快速检测方法。本研究成功建立了截短侧耳素产生菌Clitopilus passeckerianus的微量固体发酵方法和高通量效价检测方法，二者结合筛选截短侧耳素高产菌株，可以快速测定一批待测菌株的效价，替代常规摇瓶发酵菌种筛选，可大大提高截短侧耳素产生菌的育种效率，为截短侧耳素产生菌的进一步菌种筛选工作奠定了良好的基础。
【图文】：

衍生物,产生菌,担子菌,系统发育分类

图 1.1 截短侧耳素及其衍生物结构[4]耳素产生菌及其选育素产生菌属于高等真菌担子菌，详细分类上目前有几种不题在工业微生物的实际应用中，并不需要分得很细，可以不只有一种，侧耳属多种侧耳均可产生截短侧耳素。国外的系统发育分类问题，并通过分析 16sRNA 序列特征以期菌的分子生物学方法[11]。只从传统分类学上来看，能够产态学上非常不同，有的能够产生菌丝节，但是没有锁状联却还没有观察到子实体形态。所以无法从这一方面来很短侧耳素产生菌的系统分类工作还只是初步阶段，正逐越来越多的担子菌被作为开发新型天然产物药物的生物菌中发现更多的更好的活性物质，分类工作是十分必要的

菌落形态,菌落形态,高产菌株

较出发菌株的效价 12860μg/mL，提高了 25.3%。筛选得到的高产菌编号为 K40-3，其菌落形态如图2.4 所示，菌落较小，表面不光滑。图 2.4 高产菌株 K40-3 菌落形态
【学位授予单位】：兰州理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

【参考文献】