脂肪间充质干细胞向髓核样细胞定向分化的分子机制研究

发布时间：2019-10-23 01:56

【摘要】：【目的】探讨共培养环境中SD大鼠来源的髓核(nucleus pulposus, NP)细胞促使脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)向NP样细胞定向分化的分子机制,为人类椎间盘退变性疾病的细胞移植治疗奠定基础。 【方法】(1)150g SD雌性大鼠断颈处死,取腹股沟、肾周脂肪组织,0.1%胶原酶消化,体外接种培养,采用极限稀释法纯化ADSCs;同时取大鼠椎间盘髓核组织,采用组织块培养法培养NP细胞。(2)利用流式细胞术对ADSCs进行鉴定。同时对NP细胞进行Ⅱ型胶原抗体染色鉴定。(3)分别取第三代ADSCs和原代NP细胞,消化计数,调整细胞密度调至1×105/ml,ADSCs接种于六孔板中,NP细胞接种于BD培养池中;两种细胞按1:1比率通过非细胞接触共培养。(4)共培养2周后做TGF-β1受体免疫荧光检测,提取ADSCs RNA做逆转录PCR和实时荧光定量PCR检测。 【结果】(1)流式细胞检测结果显示脂肪间充质干细胞Sca-1、CD44的阳性率分别为95.2%、99.7%,CD45、CD11b的阳性率分别为0.4%、1.5%。NP细胞Ⅱ型胶原抗体免疫染色阳性。(2)免疫荧光检测结果显示:共培养组荧光强度明显高于单纯ADSCs组。NP细胞分泌的细胞因子TGF-β1作用于ADSCs ,能促使ADSCs表面的TGF-β受体1的表达增加。(3)PCR检测结果显示:共培养环境中ADSCs在NP细胞的诱导下聚焦蛋白聚糖(aggrecan)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)、sox-9等条带均明显亮于单纯ADSCs组;共培养组Smad3和Smad4基因的表达量要高于单纯ADSCs组。 【结论】实验结果表明:共培养环境中NP细胞能促使ADSCs向NP样细胞分化。
【图文】：

Genes Primerssmad2 Forward 5'CGCTGGGTGCAGGGTAGA 3'Reverse 5'TTCCATCCCAGAAGTCTCTTCAC 3'smad3 Forward 5'CCATCCCCGAGAACACTAACTT 3'Reverse 5'TGGTGGTCGCTAGTTTCTCCAT 3'smad4 Forward 5'TCACCCCAGCAAGTGTGTCA 3'Reverse 5'TGTTTTAGTTCGTTCTTGTGTAGATCAG 3'GAPDH Forward 5'CGTGAAAAGATGACCCAGATCA 3'Reverse 5'CACAGCCTGGATGGCTACGT 3'表 2 Primers for Real-time PCR

C d图 2. (a)倒置相差显微镜下 ADSCs 主要呈梭形和纺锤形，×100。 (b)ADSCs 免分子呈阳性,细胞核经 Hoechst 33258 染料复染，，×100。 (c) NP 细胞呈多角形，个卵圆形核，内可见 1-3 个核仁，×100。（d）髓核细胞Ⅱ型胶原抗体免疫染色阳
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【共引文献】

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本文编号：2551877