线粒体DNA缺失对ox-LDL诱导巨噬细胞焦亡的影响

发布时间：2017-03-19 10:02

  本文关键词：线粒体DNA缺失对ox-LDL诱导巨噬细胞焦亡的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景及目的:线粒体DNA缺失细胞(rho0细胞)是指细胞内不含有线粒体DNA,同时丧失线粒体功能,无法进行氧化呼吸而仅依靠糖酵解供能存活的一类细胞。目前rho0细胞的培养方法主要有溴化乙锭诱导法和质粒转染诱导。通过制备rho0细胞,可以对线粒体的一些重要功能,如ROS的产生,氧化磷酸化,ATP产生,电子链的传递等进行研究。细胞焦亡的发现来自早期研究胞内寄生菌对巨噬细胞作用机制。这种caspase-1依赖的细胞死亡方式不是单核巨噬细胞系所特有的,在树突状细胞及其他细胞中均有细胞焦亡的相关报导。各种刺激因素均能够诱导细胞发生焦亡,这其中不仅包括病原微生物的病原相关分子模式(PAMP),还包括来自机体自身的损伤相关分子模式(DAMP)。近期文献报导,动脉粥样硬化组织样本的免疫组化显示,活化的caspase-1在晚期粥样斑块中大量表达,同时与巨噬细胞存在共定位关系。体外实验结果表明,ox-LDL可以通过激活caspase-1分子诱导的巨噬细胞发生细胞膜溶解性死亡,并伴随有大量IL-1β和IL-18等细胞因子的释放。基因敲除实验进一步提示,CD36分子及NLRP3炎症体亦参与在此过程中。线粒体功能失常可以影响细胞对凋亡途径的调控,在线粒体DNA缺失的多种细胞系中,都表现出对凋亡的抵抗性。但是线粒体及线粒体DNA缺失在ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡中的作用及发生机制,目前尚不清楚。本研究拟通过制备线粒体DNA缺失的巨噬细胞,进一步探讨线粒体在ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡中的作用及机制,为深入研究线粒体在炎症体活化调控及其在动脉粥样硬化发生发展中的作用打下基础并提供新的思路。方法:采用含溴化乙锭的培养基连续培养J774A.1巨噬细胞90d后,采用倒置相差显微镜,观察J774A.1 rho0细胞形态;使用CCK8法检测细胞在营养缺陷培养基中增殖能力;用PCR扩增法观察线粒体编码的细胞色素C氧化酶1(cytochrome c oxidase 1,Mt COI)DNA水平与细胞核编码的18S核糖体RNA(18S r RNA)的DNA之比;采用SYBR Green染色法,观察J774A.1 rho0细胞胞内核酸;采用油红O染色观察ox-LDL处理后的巨噬细胞内脂滴的聚集情况;采用COD-PAP法检测ox-LDL处理后的巨噬细胞内总胆固醇水平;采用AO/EB染色及LDH释放实验观察ox-LDL对细胞膜完整性的影响;Western blot检测caspase-1及IL-1β的表达;采用DCFH-DA染色,在流式细胞仪上检测ox-LDL处理前后的J774A.1 rho0细胞和J774A.1细胞的胞内ROS产生;采用Mitotracker Green,Mitotracker Deep Red及DAPI染色,通过激光共聚焦显微镜检测ox-LDL处理前后的J774A.1 rho0细胞和J774A.1细胞的线粒体膜电位变化。结果:倒置相差显微镜观察结果表明,J774A.1 rho0细胞与J774A.1细胞相比具有明显形态学差异;CCK8法检测结果表明在不含丙酮酸及尿嘧啶的DMEM培养基中连续培养,J774A.1 rho0细胞的增殖受到明显抑制;溴化乙锭可抑制线粒体DNA的复制,PCR结果显示J774A.1 rho0细胞线粒体编码的Mt COI DNA水平与细胞核编码的18S r RNA的DNA比值远小于J774A.1细胞;SYBR Green染色结果进一步表明J774A.1 rho0细胞胞质的核酸量明显少于J774A.1细胞;油红O染色及COD-PAP法检测结果表明线粒体DNA缺失不影响J774A.1 rho0细胞对ox-LDL的摄取及胆固醇在细胞内的聚集;在50、100μg/ml ox-LDL分别处理J774A.1 rho0细胞及J774A.1细胞24 h后,J774A.1 rho0细胞组LDH释放分别为(27.48±3.61)%,(40.94±3.92)%,明显低于J774A.1细胞组(42.76±6.81)%,(67.3±8.05)%;AO/EB染色的结果显示,在50、100μg/ml ox-LDL作用24 h后,视野中橘红色信号所占比例J774A.1 rho0细胞组分别为(23±5.72)%,(28±11.78)%,明显低于J774A.1细胞组(45±19.03)%,(81±13.83)%;Western blot检测结果表明ox-LDL诱导J774A.1 rho0细胞caspase-1及IL-1β的表达水平明显小于J774A.1细胞;应用DCFH-D染色,流式细胞仪检测结果显示J774A.1 rho0细胞经过ox-LDL处理后,ROS生成为(58.7±0.84)%小于J774A.1细胞(91.6±0.61)%;激光共聚焦显微镜结果表明J774A.1 rho0细胞能够抵抗ox-LDL诱导的线粒体膜电位的下降。结论:1.线粒体DNA缺失的J774A.1细胞可以减少ox-LDL诱导的caspase-1及IL-1β蛋白水平表达,细胞LDH释放,表明线粒体DNA缺失能够抵抗ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡。2.线粒体DNA缺失的J774A.1细胞并不影响巨噬细胞摄取ox-LDL及胞内胆固醇的聚集。3.进一步验证线粒体DNA缺失能够抵抗ox-LDL诱导巨噬细胞焦亡的机制:线粒体DNA缺失可以导致细胞呼吸链被破坏,进而减少ROS的产生,从而抵抗ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡。同时J774A.1 rho0细胞能够抵抗ox-LDL诱导的线粒体膜电位的下降。
【关键词】：巨噬细胞 rho0 细胞 焦亡 ox-LDL ROS
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中英文缩略词表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 引言14-16
• 实验设计及流程16-17
• 实验材料17-23
• 实验方法23-30
• 结果30-43
• 讨论43-45
• 结论45-46
• 参考文献46-50
• 附录50-51
• 致谢51-52
• 综述52-66
• 参考文献62-66

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