胞外ADP在病毒感染中的功能和机制研究

发布时间：2017-03-20 04:01

  本文关键词：胞外ADP在病毒感染中的功能和机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来,不断爆发的禽流感、SARS、埃博拉等恶性病毒感染给各国人民带来了恐慌,也给现代医疗体系带来了巨大的挑战,如何预防、控制病毒性疾病的传播成为我们迫切需要解决的重大科学问题。而深入开展病毒对宿主的感染途径以及机体的抗病毒机制研究是解决这个问题的关键。众所周知,干扰素是宿主抵抗病毒感染过程中最重要的效应分子,它通过诱导下游300多种干扰素诱导基因(Interferon stimulated gene, ISGs)的表达来抵抗病毒的感染。本课题首先利用重组人IFN-a 2a刺激人外周血单核细胞,并采用Affymetrix公司的GeneChip(?) Human Transcriptome Array 2.0 (HTA2.0)对245,000个编码转录本进行系统筛查,发现嘌呤受体家族重要成员P2Y12和P2Y13的表达显著提高,呈现出典型的干扰素诱导基因的特征。随后我们在病毒感染后的细胞中也进一步明确P2Y13在病毒感染过程中表达上调。这提示我们嘌呤受体P2Y12和P2Y13在病毒感染过程中可能具有重要作用。嘌呤受体是一类以胞外核苷酸为特异性配体的细胞膜受体分子,近年来发现其在神经、心血管以及免疫功能中都发挥重要作用。有趣的是P2Y12和P2Y13虽然是不同的嘌呤受体,但是它们的配体却都是ADP。为此我们对病毒感染过程中胞外ADP的释放进行了检测,结果显示随着病毒的感染,胞外ADP的释放明显增多。这一特征进一步将我们的研究目标指向了胞外ADP及其受体P2Y12和P2Y13。因此我们分别在病毒感染的不同阶段对ADP及其受体的抗病毒功能进行了系统评价。首先,利用荧光定量PCR对病毒的数量进行检测,结果ADP不会显著影响VSV的入侵过程。但是,如果我们在病毒后期复制过程中也保持ADP的刺激,ADP处理后的细胞中VSV的数目就会明显降低。这提示我们ADP的抗病毒作用可能主要集中在病毒感染的中后期,而这种抑制作用同样也在NDV、HSV、Lentivirus等不同病毒的感染过程中发现。进而我们在VSV感染的小鼠动物模型中也发现了ADP的重要抗病毒功能。为进一步明确ADP的抗病毒机制,我们首先对其作用受体进行筛选。目前已知ADP的受体有三个P2Y1, P2Yi2和P2Y13。其中P2Y1主要激活PLC-β,而P2Y12和P2Y13主要抑制cAMP的合成。因此我们首先通过Forskolin激活腺苷酸环化酶,从而提高胞内cAMP含量以及U73122抑制PLC-β来阻断不同嘌呤受体的信号通路,然后再用VSV对细胞感染。结果表明：Forskolin能够显著抑制ADP的抗病毒功能,而U73122却没有明显作用。这提示我们ADP的抗病毒功能主要是通过P2Y12和P2Y13激活后抑制cAMP信号通路来完成的。同时我们利用CRISPRs的技术分别构建了P2Y1、P2Y12、P2Y13敲除小鼠。当野生型小鼠BMDM(骨髓来源诱导巨噬细胞)以及P2Yi、P2Yi2、P2Yi3敲除小鼠BMDM同时感染相同剂量VSV病毒时,只有P2Y13敲除小鼠BMDM相对于野生型小鼠BMDM感染病毒明显增加。因此,P2Y13在ADP抗病毒功能中是一个重要的受体。并且,在P2Y12敲除小鼠中P2Y13表达上调,其抗病毒功能也相对野生型小鼠也更加明显。因此,我们认为P2Y13是ADP抗病毒功能的主要受体。细胞内第二信使cAMP在调控细胞生理功能中发挥了十分重要的作用,但关于其在病毒感染中的功能却较少有报道,因此ADP如何通过cAMP来调控抗病毒功能成为我们接下来研究的重点。我们通过免疫印迹实验发现：病毒感染细胞过程中cAMP以及Epac1基因表达明显上调,并且ESI09(Epac1的抑制剂)能够明显抑制病毒核酸的复制。这提示我们ADP极有可能是通过与P2Y13的结合来抑制病毒诱导的cAMP/Epac1表达,从而阻止病毒在胞内的复制。综上所述,病毒感染过程中伴随着ADP的大量释放以及其受体P2Y13的表达上调,而这些释放出来的ADP通过与细胞表面的P2Y13受体结合,进而抑制胞内cAMP以及Epacl相关信号通路,最终达到抑制病毒复制的作用。我们的研究从胞外危险信号释放以及嘌呤受体激活的角度对机体的抗病毒机制进行了深入研究,明确了胞外ADP及其受体在病毒感染中的重要调控作用,为病毒性疾病的预防和相关药物的开发奠定了理论基础。
【关键词】：病毒 干扰素诱导基因 ADP 嘌呤受体 cAMP
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373
【目录】：

• 内容摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 引言13-18
• 一、病毒性疾病严重危害社会公共卫生安全13
• 二、干扰素诱导基因(ISGs)是抗病毒研究的重要靶标13-14
• 三、内源性危险信号胞外核苷酸具有重要的生理、病理功能14-15
• 四、嘌呤受体是胞外核苷酸作用的主要途径15-17
• 五、课题研究目的及意义17-18
• 第二章 病毒感染引起核苷酸释放及其受体表达上调18-29
• 第一节 材料与方法18-24
• 一、实验材料18-20
• 二、实验方法20-24
• 第二节 实验结果24-29
• 一、VSV病毒感染细胞后会引起胞外核苷酸的释放24-25
• 二、胞外核苷酸ADP受体P2Y_(12),P2Y_(13)是干扰素诱导基因25-27
• 三、病毒感染引起ADP受体P2Y_(12),P2Y_(13)表达上调27-29
• 第三章 ADP抑制病毒在细胞和小鼠组织中复制29-47
• 第一节 材料与方法29-39
• 一、实验材料29-31
• 二、实验方法31-39
• 第二节 实验结果39-47
• 一、胞外ADP不影响VSV病毒的入侵过程39-40
• 二、胞外ADP影响病毒的复制过程40-46
• 三、在动物水平探索胞外ADP的抗病毒功能46-47
• 第四章 P2Y_(13)是ADP抗病毒功能的主要受体47-60
• 第一节 材料与方法47-52
• 一、实验材料47-49
• 二、实验方法49-52
• 第二节 实验结果52-60
• 一、构建P2Y_1,P2Y_(12),P2Y_(13)的敲除小鼠52-55
• 二、在ADP执行抗病毒功能的过程中P2Y_1不是主要的受体55-57
• 三、P2Y_(13)在ADP抗病毒过程中是主要受体57-60
• 第五章 ADP抗病毒功能的主要机制60-73
• 第一节 材料与方法60-66
• 一、实验材料60-62
• 二、实验方法62-66
• 第二节 实验结果66-73
• 一、ADP正常实验浓度对细胞增殖影响不明显66-67
• 二、ADP对干扰素的表达影响不明显67-68
• 三、ADP通过抑制cAMP的合成从而抑制Epac1最终抑制病毒的复制68-73
• 第六章 研究小结与展望73-75
• 参考文献75-77
• 附录Ⅰ 缩略词77-79
• 附录Ⅱ 攻读硕士学位期间科研工作成果79-80
• 致谢80-81

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本文编号：257080