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原核表达醛(糖)还原酶及霍乱毒素类似嵌合蛋白的研究

发布时间:2017-03-20 05:07

  本文关键词:原核表达醛(糖)还原酶及霍乱毒素类似嵌合蛋白的研究,,由笔耕文化传播整理发布。


【摘要】:本论文主要涉及了三个蛋白的基因克隆表达及相关抑制剂筛选的研究,主要包括与糖尿病综合症及炎症相关的醛糖还原酶和醛还原酶,以及一种具有脑靶向作用的多亚基全新的霍乱毒素类似嵌合蛋白的基因克隆表达和纯化,及采用醛糖还原酶和醛还原酶进行抑制剂的筛选,主要得到的结果有以下三种。第一,醛糖还原酶(Aldehyde reductase AKR1B1, EC1.1.1.21)是醛酮还原酶家族成员,是多元醇通路的关键限速酶。越来越多的研究发现,AKR1B1与多种疾病有关,在一系列的炎症性疾病等中起着关键作用,与多种炎症介质的产生有直接的关系,可作为筛选非甾体抗炎药物的新靶点。为了筛选相应的酶抑制剂,为药物开发及临床应用提供参考,本研究构建了重组表达质粒pET-22b-AKR1B1-(His)6,将该质粒转化至Rosetta(DE3)宿主菌中,通过对表达条件的优化,确定表达条件为0.175 mMIPTG、14℃、80 rpm诱导14h,重组蛋白以可溶和沉淀两种形式表达。采用亲和纯化得到纯度为93%的AKR1B1-(His)6融合蛋白。使用Western blotting蛋白质进行鉴定,蛋白质序列分析仪测定氨基酸序列片段与目的蛋白序列比对。利用体外酶动学方法测定AKR1B1-(His)6的比活力为(9.4±0.23)U/mg。使用该蛋白建立醛还原酶抑制剂筛选方法,分别测定已上市的13种非甾体抗炎药(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs,NSAIDs)对AKR1B1-(His)6的抑制活性。结果表明,萘普生、双氯芬酸、氟灭酸、布洛芬等对融合蛋白AKR1B1-(His)6有较强的抑制作用,可与抗糖尿病并发症药物联合用药。醛还原酶(Aldehyde reductase AKR1A1, EC 1.1.1.2)是醛酮还原酶家族成员,能将有毒醛还原成相应的醇。为研究非甾体抗炎药对AKR1A1的抑制作用,为非甾体抗炎药的副作用及临床应用提供参考,本研究构建了重组表达质粒pET-22b-(His)6-DDDD K-AKR1A1,将该质粒转化至Rosetta(DE3)宿主菌中,通过对表达条件的优化,确定表达条件为0.25 mMIPTG,16℃,80 rpm诱导14h,重组蛋白以可溶形式表达。采用亲和纯化得到纯度为90%的pelB-(His)6-DDDDK-AKR1A1融合蛋白。重组蛋白用肠激酶特异性剪切,经过Ni-NTA、Sephadex G-75再次纯化,得到纯度为98%的野生型AKR1A1蛋白。使用Western blotting和蛋白质序列分析对蛋白质进行鉴定。利用体外酶动学方法测定(His)6-DDDDK-AKR1A1的比活力为(41.3±0.1)U/mg、AKR1A1比活力为(79.4±0.15)U/mg。奥沙普秦、酮基布洛芬、氟灭酸、托芬那酸等对AKR1A1有很强的抑制作用,为抗炎药副作用提供参考。为了得到一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质,本研究还使用原核共表达系统,设计表达了一种全新的霍乱毒素类似嵌合蛋白。分别获得重组质粒pET-28a-CTB和pET-22b-EGFP-CTA2-TAT,利用pET-28a-CTB和pET-22b-EGFP-CTA2-TAT二者不同抗性,将双质粒分步转化到大肠杆菌BL21中。优化表达条件后,重组嵌合蛋白能以可溶形式表达。经过Ni-NTA、Sephadex G-75纯化,Western blotting对蛋白质进行鉴定,确定获得(CTB)5/EGFP-CTA2-TAT嵌合蛋白,为该蛋白进一步的入脑研究提供了物质基础。
【关键词】:醛糖还原酶 醛还原酶 组氨酸标签 非甾体抗炎药 嵌合蛋自
【学位授予单位】:广东工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R3411
【目录】:
  • 摘要4-6
  • Abstract6-8
  • 目录8-12
  • CONTENTS12-16
  • 缩写16-17
  • 第一章 绪论17-24
  • 1.1 醛酮还原酶家族命名17
  • 1.2 醛糖还原酶17-19
  • 1.2.1 醛糖还原酶的结构17-18
  • 1.2.2 醛糖还原酶的分布18-19
  • 1.2.3 醛糖还原酶的生理功能19
  • 1.3 醛还原酶的介绍19-21
  • 1.3.1 醛还原酶的结构19-20
  • 1.3.2 醛还原酶的分布20
  • 1.3.3 醛还原酶的生理功能20-21
  • 1.4 入脑蛋白设计21-24
  • 1.4.1 霍乱毒素蛋白21-22
  • 1.4.2 增强型绿色荧光蛋白22
  • 1.4.3 TAT蛋白22
  • 1.4.4 脑靶向蛋白转运功能22-24
  • 第二章 醛糖还原酶的克隆、表达与研究24-50
  • 2.1 引言24
  • 2.2 实验材料、试剂和仪器24-29
  • 2.2.1 菌株和质粒24
  • 2.2.2 试剂24-25
  • 2.2.3 溶液配制25-28
  • 2.2.4 仪器28-29
  • 2.3 实验方法29-38
  • 2.3.1 AKR1B1基因片段的获得29
  • 2.3.2 pET-22b(+)-AKR1B1重组表达载体构建29-34
  • 2.3.3 表达宿主菌的选择34
  • 2.3.4 测定Rosetta(DE3)的生长曲线34
  • 2.3.5 目的蛋白的表达34
  • 2.3.6 目的蛋白的纯化34-36
  • 2.3.7 目的蛋白鉴定36
  • 2.3.8 AKR1B1-(His)_6酶浓度测定36-37
  • 2.3.9 重组AKR1B1-(His)_6酶活性测定及动力学分析37-38
  • 2.4 实验结果与讨论38-49
  • 2.4.1 目的基因PCR扩增38
  • 2.4.2 pET-22b-AKR1B1-(His)_6表达载体的构建38-42
  • 2.4.3 表达菌种的选择42-43
  • 2.4.4 测定Rosetta(DE3)的生长曲线43-44
  • 2.4.5 目的蛋白的表达44-45
  • 2.4.6 目的蛋白的纯化45-46
  • 2.4.7 目的蛋白鉴定46-47
  • 2.4.8 目的蛋白氨基酸测序47
  • 2.4.9 醛糖还原酶溶度测定47-48
  • 2.4.10 醛糖还原酶活性测定48-49
  • 2.5 本章小结49-50
  • 第三章 醛还原酶的克隆、表达与活性测定50-63
  • 3.1 引言50
  • 3.2 实验材料、试剂和仪器50-51
  • 3.2.1 菌株和质粒50
  • 3.2.2 试剂50
  • 3.2.3 溶液配制50-51
  • 3.2.4 仪器51
  • 3.3 实验方法51-54
  • 3.3.1 (His)_6-DDDDK-AKR1A1基因的优化与合成51
  • 3.3.2 pET-22b-(His)_6-DDDDK-AKR1A1重组表达质粒的构建及鉴定51-52
  • 3.3.3 融合蛋白的表达、纯化及肠激酶切割52-53
  • 3.3.4 融合蛋白的诱导表达条件优化53
  • 3.3.5 目的蛋白鉴定53-54
  • 3.3.6 重组AKR1A1酶活性测定及动力学分析54
  • 3.4 实验结果与讨论54-62
  • 3.4.1 pET-22b-(His)_6-DDDDK-AKR1A1原核表达质粒的构建54-58
  • 3.4.2 pe1B-(His)_6-DDDDK-AKR1A1表达、纯化及肠激酶切割58-59
  • 3.4.3 pe1B-(His)_6-DDDDK-AKR1A1重组蛋白表达条件的优化59-61
  • 3.4.4 重组蛋白鉴定61
  • 3.4.5 AKR1A1蛋白的活性测定61-62
  • 3.5 本章小结62-63
  • 第四章 非甾体抗炎药对醛糖还原酶与醛还原酶抑制性的研究63-68
  • 4.1 引言63
  • 4.2 实验材料、试剂和仪器63-64
  • 4.2.1 试剂63-64
  • 4.2.2 溶液配制64
  • 4.2.3 仪器64
  • 4.3 实验方法64-65
  • 4.3.1 非甾体抗炎药物对AKR1B1的抑制研究64-65
  • 4.3.2 非甾体抗炎药物对AKR1A1的抑制研究65
  • 4.4 实验结果与讨论65-67
  • 4.4.1 抗炎药对AKR1A1、AKR1B1的IC_(50)值测定65-67
  • 4.5 本章小结67-68
  • 第五章 不相容双质粒共表达霍乱毒素类似嵌合蛋白68-85
  • 5.1 介绍68-69
  • 5.2 实验材料、试剂和仪器69
  • 5.2.1 菌株、质粒69
  • 5.2.2 试剂69
  • 5.2.3 溶液配制69
  • 5.2.4 仪器69
  • 5.3 实验方法69-73
  • 5.3.1 编码CTB基因的工程菌构建69-70
  • 5.3.2 编码EGFP-CTA2-TAT基因的工程菌构建70
  • 5.3.3 分步转化获得目的蛋白表达工程菌70-71
  • 5.3.4 测定BL21(DE3)的生长曲线71
  • 5.3.5 重组蛋白在大肠杆菌中的表达71-72
  • 5.3.6 目的蛋白鉴定72-73
  • 5.4 实验结果73-84
  • 5.4.1 pET-28a-CTB原核表达质粒的构建73-76
  • 5.4.2 pET-22b-EGFP-CTA2-TAT原核表达质粒的构建76-79
  • 5.4.3 分步转化获得目的蛋白表达工程菌79-81
  • 5.4.4 细菌生长曲线测定81
  • 5.4.5 目的蛋白表达、纯化81-83
  • 5.4.6 目的蛋白的鉴定83-84
  • 5.5 本章小结84-85
  • 结论与展望85-87
  • 参考文献87-93
  • 攻读硕士学位期间发表的论文93-94
  • 附录94-98
  • 致谢98

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