酸敏感离子通道的结构与功能关系研究

发布时间：2020-01-28 17:32

【摘要】：酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)属于上皮钠通道degenerin/epithelial Na+ channel (DEG/ENaC)家族,是一种由细胞外的质子激活的非选择性阳离子通道。到目前为止,由四种基因编码的6种酸敏感离子通道亚基己被鉴定,分别是亚型ASICla、1b、2a,2b、3、4。它们分别分布在中枢和外周的神经系统中,并在诸多的生理和病理功能中发挥作用。在外周神经系统中,ASICs发挥感觉感受器的作用,例如伤害感受和机械感受。中枢神经系统中,ASICs与突触可塑性,学习记忆、恐惧记忆,脑缺血性损伤、癫痫和神经免疫等生理和病理活动相关。伴随着ASIC晶体结构得到解析的“后晶体时代”的到来,以其晶体结构为基础的研究也越来越多地涌现。本文也基于ASIC的晶体结构,对通道的表达调控和开放的结构机制进行了研究。由于ASICs是由细胞外质子激活的膜离子通道,所以理解ASICs在膜表面的分布,对于酸化条件下的细胞信号转导是必须的。在本论文第一部分的研究中,我们着重描述了存在于ASIC3型胞外手指域的一对由D107-R153组成的保守盐桥(对应于ASIC1a通道的为D107-R160)在ASICs中的功能和结构基础。我们使用点突变结合电生理检测,发现这对盐桥在ASICs的功能发挥中是至关重要的,即针对盐桥的任何微小的破坏都会导致整个通道电生理功能的下降或丧失,且这种作用并不是来自于ASICs pH感受性的下降。将突变体通道转染细胞并用生物素-亲和素法在突变通道上提取细胞膜蛋白后用Western-blotting法进行半定量分析,以及使用HA标记膜表面后进行免疫荧光检测的实验结果均表明,这对盐桥中细微结构的破坏会导致通道上膜水平的降低。分子动力学模拟,简正模式分析以及在盐桥周围的残基进行更多突变氨基酸筛选的结果表明此对盐桥具有很高的结构稳定性和刚性,而这种刚性作用将盐桥附近影响上膜的刚性区域“信号斑”(signal patch)和柔性较大的门控区域(gating domain)从结构上分隔开,从而在ASIC的上膜功能中发挥重要作用。此外,盐桥和其毗邻的“信号斑”一起形成的刚性区域,可能是ASIC蛋白在装配上膜的过程中所需伴侣蛋白的潜在结合位点。本研究在国际上首次发现了ASIC在膜上正常表达所必须的一种胞外结构并推测了其作用的可能结构机制。此发现可以用来评价源于组织酸化、激活ASIC相关过度兴奋性和针对神经损伤的预防策略研究。通常情况下,ASIC3由质子诱导的电流分为两相：一相是瞬间激活并失活的峰电流,另一相是随之而来较小的持续平台电流。ASIC3通道的持续激活可能参与了酸化有关的痛觉感受以及感觉整合。对于ASIC3通道持续电流结构基础的研究为针对ASICs新型镇痛药的研发提供了可能。其作为本论文第二部分的研究,我们利用一种能显著增强ASIC3持续电流的生物体内源性小分子多肽FMRF-NH2作为探针,来研究ASIC3持续电流的结构基础和分子机制。使用定点突变,电生理检测,化学合成,共价修饰,以及分子动力学模拟,我们发现了一个存在于胞外域三个亚基交界面上的E79-E423-Q269-Q271 (EEQQ)相互作用复合体。EEQQ复合体参与了ASIC3通道在酸化下的持续电流的产生；在复合体上的单突变或共价修饰都能导致酸化下持续电流大小的变化。更多的分子动力学模拟,简正模式分析以及双突变循环分析结果反映出EEQQ复合体作为一个开关,通过构象变化机制,控制β-linker结构与拇指域的结合与解离,从而产生使ASIC3通道脱敏或持续激活的不同效果。本研究结果解释了ASIC一种内源性调节的具体机制,并在以往ASIC门控的研究基础上提出了通道持续开放的新构象传导通路,为开发治疗炎症痛等疾病的新型药物提供了全新的结构模型和新的干预途径。
【图文】：

盐桥,残基,王维

Ｆｉｇｕｒｅ邋３．１邋Ｔｈｒｅｅ邋ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ邋ａｎｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ｄｉｅ邋Ｄ－民邋ｉｒＵｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｉ＊ｅｇｉｏｎ逡逑．ａｔ邋化ｅ邋ｅｄｇｅ邋ｏｆ邋化ｅ邋ｆｉｎｇｅｒ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｏｆ邋ＡＳＩＣｓ．逡逑图３．１在ＡＳＩＣｓ家族中，手指域上Ｄ－Ｒ氨基酸残基相互作用对的王维结构和序列比对。逡逑４邋Ｓ化ｒｅｏ邋ｖｉｅｗ邋ｏｆ邋化ｅ邋ｃｒｙｓｔａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｃＡＳＩＣｌ邋（ＰＤ艮邋ｃｏｄｅ：邋３ＨＧＣ）邋ｗｉ化邋ｋｅｙ邋化ｓｉｄｕｅｓ逡逑（ｄｉｓｐｌａｙｅｄ邋ｉｎ邋ｇｒｅｙ邋ｓｔｉｃｋｓ邋ｆｏｒ邋ｅｍｐｈａｓｉｓ）邋ｉｎｖｏｌｖｅｄ邋ｉｎ邋ｆｏｒｍｉｎｇ邋化ｅ邋Ｄ１０８－民邋１６１邋ｓａｌｔ－ｂｒｉｄｇｅ邋ｅｎｌａｒｇｅｄ．逡逑Ｒｅｄ邋ｂｒｏｋｅｎ邋ｌｉｎｅｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｂｏｎｄｉｎｇ邋ａｍｏｎｇ邋ｐｏｌａｒ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ．邋Ｂ，邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ａｌｌ逡逑ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ＡＳＩＣ邋ｃｈａｎｎｅｌｓ邋ａｔ邋化ｅ邋ｃｏｎ化ｒｖｅｄ邋ｓａｌｔ－ｂｒｉｄｇｅ邋ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ．邋Ｔｈｅ邋ｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ邋ｉｓ逡逑ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｒＡＳＩＣ３邋ｃｈａｎｎｅｌ．逡逑Ａ邋ｃＡＳＩＣｌ的晶体结构图（阳Ｂ码：３ＨＧＣ，，上图），形成Ｄ１０８－Ｒ１６１盐桥的关键氨基酸逡逑残基放大Ｗ棒状显示于下图（灰色）。红色虚线代表在极性残基之间形成的氨键。６

盐桥,突变体,野生型,通道

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【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

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