HMGB1在ALD-DNA诱导巨噬细胞活化及SLE发病中的作用

发布时间：2020-01-28 17:37

【摘要】：系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是严重危害人类健康的自身免疫性疾病,患者体内针对自身核抗原产生高水平的自身抗体如抗双链DNA抗体(anti-dsDNA Ab),形成免疫复合物,沉积于全身各组织基底膜导致慢性炎症损伤,临床表现为病情反复、迁延不愈,其发病机制仍不清楚。研究表明自身核成分可能是SLE发病的自身免疫原；但在正常情况下,哺乳动物DNA等核成分的免疫原性较差,一般不能在动物体内诱导抗体产生；但是抗双链DNA抗体的存在又提示DNA可能是其免疫原,因而阐明自身DNA如何打破免疫耐受从而激活免疫系统是阐明SLE发病机制的热点和重点。我们实验室在寻找SLE疾病自身免疫原的过程中发现：活化淋巴细胞来源的DNA (Activated Lymphocyte-derived DNA, ALD-DNA)免疫同系BALB/c小鼠能诱导以血清高水平抗dsDNA抗体、蛋白尿、肾小球肾炎和肾脏免疫复合物荧光沉积为典型表现的SLE样综合征；而在相同条件下,正常淋巴细胞来源的DNA (UnALD-DNA)却不能诱导SLE疾病的发生。进一步研究发现,ALD-DNA可通过诱导巨噬细胞活化分泌炎症细胞因子,从而导致SLE的发生；但是,ALD-DNA活化巨噬细胞的具体机制还不清楚。高迁移率族蛋白Bl (high mobility group protein Bl, HMGB1)由A盒和B盒及C端尾部结构域构成,是广泛存在于真核细胞核中最重要的非组蛋白。研究发现,HMGB1能够结合各种核酸成分,并活化下游核酸特异性受体,从而诱导巨噬细胞分泌大量炎性细胞因子,在机体免疫系统对核酸成分应答的过程中可能扮演者重要角色；HMGB1也被认为是一种固有免疫危险信号(danger signal)或一种可能的分泌型固有免疫识别受体(PRR)。HMGB1是否在ALD-DNA诱导巨噬细胞活化和SLE发病中发挥作用及其可能机制引起了我们的关注。基于我们的前期研究以及国内外相关研究的现状,推测HMGB1作为机体组织细胞或免疫细胞释放的危险信号,感知危险的大量释放的自身凋亡DNA,而后激活巨噬细胞的固有免疫,从而启动自身免疫应答。本课题旨在探讨HMGB1在ALD-DNA活化巨噬细胞过程中的作用及其机制,并进一步研究其在ALD-DNA诱导的SLE发病中的作用,以期为SLE的防治提供新的理论基础和实验依据。第一部分HMGB1在ALD-DNA诱导巨噬细胞活化中的作用我们研究发现,ALD-DNA可有效诱导巨噬细胞活化,明显上调巨噬细胞表面协同刺激分子的表达,并显著诱导其分泌IL-6,IL-12和TNF--α等炎性细胞因子。有趣的是,我们发现ALD-DNA能够显著诱导巨噬细胞的HMBG1的分泌,且HMGB1的分泌表达水平和炎性细胞因子的产生呈正相关,对ALD-DNA刺激具有明显的剂量依赖效应。进一步研究发现,应用siRNA下调HMGB1的表达可以明显抑制ALD-DNA诱导的巨噬细胞炎性细胞因子的产生以及HMGB1的分泌；应用胞外HMGB1的特异性阻断剂A盒肽能够显著抑制ALD-DNA诱导的炎性细胞因子分泌,并呈剂量依赖效应；提示HMGB1参与了ALD-DNA激活的巨噬细胞活化。进一步研究HMGB 1对巨噬细胞的活化作用,发现：以单纯HMGB1蛋白作用巨噬细胞,不能诱导巨噬细胞炎性细胞因子的分泌,排除了HMGB1本身具有诱导巨噬细胞活化的作用。而外源性HMGB 1蛋白能够显著上调ALD-DNA而不是UnALD-DNA诱导的巨噬细胞炎性细胞因子分泌,提示,胞外HMGB1在ALD-DNA诱导的巨噬细胞活化中具有关键作用。进一步应用竞争性ELISA结合实验和圆二色谱分析方法检测HMGB]和ALD-DNA的结合情况。结果发现HMGB1可以有效地与ALD-DNA结合形成复合物,并具有剂量依赖效应。已知HMGB1的巨噬细胞识别受体为TLR2、TLR4和RAGE,为进一步研究HMGB 1-ALD-DNA复合物诱导炎性细胞因子分泌的受体通路和分子机制,我们首先应用TLR2/4抑制剂观察TLR2和TLR4是否参与ALD-DNA-HMGB1诱导的巨噬细胞活化,结果发现TLR2/4抑制剂对ALD-DNA的巨噬细胞活化没有明显影响;进一步用RAGE siRNA和RAGE-Fc分别抑制RAGE的表达和作用,再以ALD-DNA刺激巨噬细胞,结果发现RAGE siRNA和RAGE-Fc均能显著抑制ALD-DNA诱导巨噬细胞炎性细胞因子的分泌,提示RAGE对HMGB1的识别介导了ALD-DNA诱导的巨噬细胞活化。以上研究结果表明,ALD-DNA刺激巨噬细胞分泌HMGB 1,并与其结合形成炎性复合物,通过RAGE信号通路启动免疫应答,这可能是ALD-DNA诱导巨噬细胞活化的重要机制之一第二部分HMGB1在ALD-DNA诱导SLE发病中的作用为深入探讨HMGB1在ALD-DNA诱导SLE发病中的可能作用,我们进行体内动物试验,检测了ALD-DNA免疫小鼠血清中HMGB1的水平,结果发现ALD-DNA免疫小鼠血清中的HMGB1水平显著高于正常DNA免疫组和正常对照组小鼠,提示HMGB1可能参与了ALD-DNA诱导的SLE的发病。为了验证HMGB1在ALD-DNA诱导SLE疾病中的作用,我们通过肌肉注射HMGB1真核过表达质粒来上调小鼠体内HMGB1的水平,并通过腹腔注射HMGB1的体内抑制剂甘草皂苷来抑制小鼠体内HMGB1的作用,同时以ALD-DNA免疫小鼠3次,诱导SLE样综合症。结果发现,HMGB1过表达组小鼠经ALD-DNA免疫后,其血清HMGB1水平、抗双链DNA抗体和尿蛋白水平均明显上调,肾脏病理改变更为严重；而胞外HMGB1的体内阻断剂显著下调了ALD-DNA免疫小鼠诱导的抗双链DNA抗体和尿蛋白水平,并且未观察到明显肾肾脏病理改变；提示HMGB1在ALD-DNA诱导的SLE发病中具有重要作用。我们进一步研究发现,ALD-DNA刺激HMGB1过表达免疫小鼠体内巨噬细胞分泌的炎性细胞因子水平明显高于甘草皂苷抑制组小鼠,提示体内HMGB1在巨噬细胞对ALD-DNA的刺激反应中具有重要作用,这也可能是二者SLE发病严重程度不同的机制之一。本研究在ALD-DNA诱导小鼠SLE综合症的动物模型基础上,关注一种新的固有免疫DNA感受器-HMGBl,证实其在ALD-DNA刺激的巨噬细胞及小鼠体内显著上调分泌；HMGB1可直接结合ALD-DNA,并通过巨噬细胞RAGE信号通路激活巨噬细胞,并在ALD-DNA诱导的SLE发病中发挥重要作用。本研究为阐明SLE发病的固有免疫识别机制和调控提供了新的数据和思路,并提供了基于HMGB1的SLE治疗新靶点。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【参考文献】