【摘要】：研究背景我国是肝炎频发大国。重组人干扰素是目前国际上公认的有效治疗肝炎的药物,对于基因重组药物来说,药品的质量控制是我们关注的焦点,其中药品的鉴别实验是药品定性检测的主要依据。对于重组人干扰素来说,根据《中国药典》2015版三部,对重组人干扰素α2b制品进行鉴别实验,主要采用免疫学检测方法(免疫斑点或免疫印迹)。此方法周期长,成本高,抗体间有批次的差异且全过程需要低温运输与保存,不利于快速检测。本课题筛选出的纳米抗体,采用原核表达体系进行生产,降低了生产成本,全过程无需冷链运输,且开发出了胶体金试纸条,实现了快速检测。研究方法1、通过免疫动物羊驼,检测免疫效价达到建库要求,收集血清中的淋巴细胞,得到cDNA文库,采用通用引物进行扩增、酶切、连接、电转化,建立噬菌体文库。2、针对重组人干扰素α2b进行多轮富集和筛选,得到一株靶向重组人干扰素α2b的纳米抗体,将其命名为I_(22),进行了ELISA和Western Blot验证。3、构建了pET28a-His-I_(22)-His,pET28a-His-I_(22),pET28a-I_(22)-His三株原核表达质粒载体,对其进行表达和纯化。4、进行部分理化性质方面的研究如全柱成像毛细管等电点的检测,N端测序,质谱分子量的测定,同时采用药典的方法将纳米抗体I_(22)、商品化的单克隆抗体、多克隆抗体分别与重组人干扰素α2b标准品进行抗体中和实验,验证它们对重组人干扰素α2b制品生物活性的影响。5、将纳米抗体I_(22)放置在室温下保存,对其进行免疫鉴别试验,并且与商品化的单克隆抗体进行灵敏度检测比较。建立半定量检测重组人干扰素α2b的含量的方法,并且将纳米抗体I_(22)与胶体金标记,开发胶体金试纸条进行快速检测。研究结果1、获得库容量为2.6×10~8的抗重组人干扰素α2b纳米抗体的基因文库,经过噬菌体救援得到抗重组人干扰素α2b纳米抗体噬菌体展示文库,测滴度为3.1×10~(13)CFU/mL。2、对筛选的阳性克隆,分别进行ELISA和Western Blot实验对其进行验证,经ELISA验证总共得到2个阳性克隆,将阳性克隆进行测序,分析结果经对比得到相同的序列,将它命名为纳米抗体I_(22)。Western Blot验证阳性克隆的上清与重组人干扰素α2b进行特异性结合。3、将三株构建的菌株pET28a-His-I_(22)-His,pET28a-His-I_(22),pET28a-I_(22)-His都进行了诱导表达,得到了分子量大致相等的蛋白,且都能与重组人干扰素α2b进行结合,没有明显的差异。在理化性质检测与应用实验中都采用pET28a-His-I22-His表达的目的蛋白进行研究,目的蛋白的产量约为45.7mg/L,纯度为100%。4、经全柱成像毛细管测得纳米抗体的等电点约8.20。N端测序测得氨基酸序列与理论结果一致。质谱测得纳米抗体I_(22)分子量为14226.80Da,与理论分子量14226.77Da一致。证明纳米抗体I_(22)与商品化的单克隆抗体对重组人干扰素α2b制品的生物活性没有影响,多克隆抗体对重组人干扰素α2b制品生物活性有影响。5、纳米抗体I_(22)应用于Western Blot实验中,且对重组人干扰素α2b制品有特异性,对重组人干扰素α2b制品中的辅料人血白蛋白没有结合作用。将纳米抗体I_(22)与商品化的单克隆抗体(抗重组人干扰素α2b)进行比较分析,证明纳米抗体的检测限约为31.25ng,同等实验条件下商品化的单克隆抗体的检测限约为125ng。纳米抗体I_(22)应用于半定量检测重组人干扰素α2b的含量,精确度高,实验结果准确。纳米抗体I_(22)与胶体金标记技术相结合,检测重组人干扰素α2b的检测限可达到1μg/mL。结论本文首次得到了抗重组人干扰素α2b纳米抗体的基因序列,构建到原核表达体系大肠杆菌中得到了可溶性表达,对表达的目的蛋白进行Western Blot验证,证明纳米抗体I_(22)比商品化的单克隆抗体更灵敏,且不受温度的影响,商品化的抗体产量约为25mg/L,纳米抗体的产量约为45.7mg/L,经镍柱纯化得到纯度100%,降低了生产成本。开发的胶体金试纸条可以实现快速检测,将原本耗时两天的免疫鉴别试验缩短为几分钟完成的快速检测,实现了快速检测的初步应用。
【图文】：
图 1.1 胶体金抑制法结果示图[14]体的研究进展抗体的发现年比利时自由大学研究所，在分离沙特阿拉伯骆驼血[15]的抗体清中出现比普通传统抗体分子量小的蛋白[16]，经过还原电泳等的蛋白片段，与普通传统的抗体有差异[17]（如图 1.2 所示一步的研究，发现比普通传统抗体分子量小的抗体即重链抗变区即我们所说的纳米抗体[18]。
图 1.1 胶体金抑制法结果示图[14]米抗体的研究进展 纳米抗体的发现1993 年比利时自由大学研究所，在分离沙特阿拉伯骆驼血[15]的抗体过发现血清中出现比普通传统抗体分子量小的蛋白[16]，经过还原电泳发子量相等的蛋白片段，与普通传统的抗体有差异[17]（如图 1.2 所示）开了进一步的研究，发现比普通传统抗体分子量小的抗体即重链抗体体的可变区即我们所说的纳米抗体[18]。
【学位授予单位】：中国食品药品检定研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【参考文献】
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2587707
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