水杨酸钠诱导的耳鸣大鼠听觉通路带状突触及听皮层可塑性的研究

发布时间：2020-03-24 03:13

【摘要】：目的:耳鸣是当前发病率较高、治疗效果较差的常见病。在成年人的流行病学调查发现,患有程度不同耳鸣的大约占6%-10%,其中还有一部分人因为耳鸣问题甚至影响正常的工作及生活~([1]),成为临床上迫切解决的难题之一。关于耳鸣的发病机制目前还不是很清楚,有许多假说,最主要的假说主要有两种:一、认为耳鸣与外周的听觉系统有关:二、认为耳鸣的发生主要与听觉中枢系统发生的可塑性有关。基于上述两种假说,本文从听觉通路上外周及中枢听觉系统两个点分别进行研究,探讨耳鸣还不为人知的发病机制,在今后耳鸣的研究,临床治疗上提供新的理论基础。目前,关于耳鸣与外周听觉系统的研究已有很多,对内毛细胞带状突触(ribbon synapse,RS)的研究目前较少,它是将声音信息传递到听觉神经中枢的第一个传入神经突触。众所周知,突触的传递效能不是固定不变的。突触神经元发生兴奋时,引起神经递质产生释放,这个过程会引起突触后电位发生改变,来达到完成电信号发生传递的目标,在这个过程中,我们可以发现突触在数量、功能和形态三方面均发生了改变。在这个变化过程中,突触传递功能有可能发生增强,也有可能出现减弱;在时间上可以是时间较短(数秒到数分钟);也可以是时间较长(数小时到数周)。这些变化统称为突触可塑性。带状突触发生的可塑性变化,包括数量、结构及功能变化会影响声音的编码,目前关于这方面的研究还比较少。基于上述考虑,本研究拟在水杨酸钠诱导的耳鸣的大鼠模型中,应用免疫荧光双标的方法,分别对RIBEYE蛋白(突触前结构蛋白)及GluR2-3蛋白(突触后膜受体蛋白)进行标记,3Dmax8.0软件三维重建后的数量分析;应用透射电镜观察内毛细胞带状突触的微观结构在耳鸣发生前后的变化察;Western blotting对otoferlin蛋白进行半定量检测,通过检测otoferlin蛋白的变化,间接反应带状突触功能方面的变化。综上所述,本研究对内毛细胞带状突触数量、结构及功能的可塑性进行研究,可以对耳鸣发病机制的研究有一个新的补充。在研究耳鸣发病机制中,人们越来越关注听皮层神经可塑性在耳鸣发病过程中的作用,比较公认的观点认为:当突触传入信号发生改变时,会导致神经兴奋性短时间或长时间发生继发改变。这些改变包括很多方面:神经元细胞膜发生变化(如离子通道出现开放或关闭)、突触发生改变(如神经递质的释放、摄取及结合)、神经的敏感性和分布范围出现变化。Moller等~([2])在动物实验的研究中发现,当动物出现听力下降及耳聋时,突触传入信号发生改变,整个听觉系统出现了一种超敏反应,这种超敏反应会被时听觉中枢误认为声音,这种误认就是耳鸣的发生鸣。实现突触可塑性的机制有很多,包括改变释放到突触的神经递质的量以及细胞对这些神经递质的应答方式~([3])。通过改变突触上神经递质受体的数量也可以实现突触可塑性的变化~([4])。研究发现,兴奋性和抑制性神经突触的突触可塑性均依赖于突触后钙离子(Ca~(2+))的释放~([4-5])。Ca~(2+)在调节细胞代谢方面十分重要,是第二信使。在调控神经细胞的生长、分化、突触可塑性和死亡等方面Ca~(2+)信号通路发挥着十分重要的作用。钙调蛋白(Calmodulin,CaM)是主要的Ca~(2+)结合蛋白,调控许多神经细胞的重要功能~([6])。而Ca~(2+)/CaM依赖的蛋白激酶II(CaMKII)在突触可塑性发生改变的过程中是关键蛋白~([7-8]),负责联系神经元兴奋转录。到目前为止,有关耳鸣状态下听皮层细胞内Ca~(2+)浓度以及CaM/CaMKII信号转导途径中蛋白激酶的变化情况,尚未见报道。因此,我们采用水杨酸钠诱导建立耳鸣大鼠模型,检测耳鸣大鼠听皮层中可塑性变化相关蛋白(CaM和CaMKII)的表达情况,探讨耳鸣发生的中枢听皮层源性发病机制。研究方法:选用Wistar大鼠72只,无外耳和中耳疾病,由中国医科大学动物实验中心提供。2月龄,体重245±21.21g。使用ABR进行听力评估。将大鼠随机分为3部分,每部份分为4组,每组6只,其中的三组采用水杨酸钠腹腔注射,350mg/kg,分别注射3d(3d组)、7d(7d组)、10d(10d组),另一组为对照组:为等时间点等体积腹腔注射生理盐水。麻醉后,手术分离出耳蜗基底膜,一部分应用免疫荧光双标记的方法,即绿色荧光代表CtBP2;红色荧光代表突触后膜GluR2-3。红色和绿色荧光的同时出现表现的颜色为橙黄色,它的意义代表存在一个带状突触。在激光共聚焦显微镜下,扫描耳蜗基底膜,利用3Dmax8.0软件三维重建,分析内毛细胞带状突触数量的变化过程;一部分在透射电镜下进行观察,分析带状突触内部微观结构方面在耳鸣发生前后出现的变化。带状突触是一个不断发生变化的动态结构,在水杨酸钠作用下,观察带状突触微观结构表现出的不同特点;另一部分,Western blotting的方法检测otoferlin蛋白的表达。Otoferlin蛋白在突触神经递质的胞吐过程中发挥作用。水杨酸钠作用的不同时间点,otoferlin蛋白质表达发生变化,这些变化能间接反应突触的功能情况。另一实验中,我们再选用Wistar大鼠36只,由中国医科大学动物实验中心提供,随机分成3组,每组12只:空白对照组、生理盐水组和耳鸣模型组。耳鸣模型组通过腹腔注射水杨酸钠,350mg/kg,饮水抑制法行为学验证造模成功。运用Fura-2/AM荧光分光光度计方法测定各组大鼠听皮层神经细胞内游离Ca~(2+)浓度;Western Blot方法检测CaM/CaMKII表达及活性情况。结果:1、实验大鼠经过8天条件反射训练,均建立稳定条件反射。在条件反射消退期,耳鸣组小鼠条件反射消退时间最短,统计分析显示,各组间的差别具有统计学意义(P0.05),耳鸣模型制作成功。2、对内毛细胞带状突触数量方面的研究分析发现,注射水杨酸钠第7d时,观察到的带状突触数量最多,与对照组相比(P0.05);注射水杨酸钠第3d时,带状突触数量没有出现明显改变;注射第10d时,带状突触数量却出现了一个明显的下降(P0.05)。3、在透射电镜下,耳蜗内毛细胞核下区域带状突触结构可以清晰看到,包括带状突触、囊泡、突触间隙,还有突触后致密带等这些典型结构;在动态观察注射水杨酸钠的不同时间点上,内毛细胞带状突触的超微结构和形态也不断发生着改变,各不相同。4、Western blotting法检测在140.5KD的位置检测到otoferlin的表达。各时间点otoferlin表达量不断发生变化,注射前otoferlin蛋白的表达还不是很高,在注射第3d时表达量已经开始出现了增加,在第7d时,我们可以看到表达量是最多的,在第10d时表达量反而出现了下降的趋势。各时间点otoferlin蛋白表达在各组间存在的差异是显著的(P0.05)。5建立了大鼠耳鸣行为学模型后,耳鸣模型组的Ca~(2+)浓度出现了显著升高(P0.05);同时,听皮层神经细胞CaM表达也出现增高(P0.05)、CaMKII活性出现增强(P0.05)。结论:1、本课题使用的内毛细胞带状突触数量的研究方法,可以解决因为带状突触不存在于同一平面,不能准确计算突触数量的难题。2、注射水杨酸钠后,内毛细胞带状突触的数量出现不断变化,刚开始呈现一个逐渐升高的状态,随之又出现了减少,增加或减少了与螺旋神经元之间的联系,对耳鸣起到一定代偿的作用。3、内毛细胞带状突触在注射水杨酸钠前后,它的形态和微观结构也同时发生着动态变化,不同时期有不同的结构特点,这种微观结构上的动态变化可能影响突触的功能。4、otoferlin蛋白表达在水杨酸钠注射前后也发生着动态变化,可能机制是:otoferlin表达增加,提高了突触内囊泡的融合及突触递质的释放。otoferlin蛋白表达后期出现下降,考虑可能的原因为影响突触新陈代谢,原有的形态和功能不能维持,影响otoferlin的表达。5、耳鸣大鼠听皮层神经细胞Ca~(2+)浓度的增加及其下游CaM/CaMKII信号转导通路的激活参与水杨酸钠诱导的耳鸣发生,听觉中枢的听皮层内,有神经异常电活动及神经细胞突触可塑性的出现,听觉中枢出现的这些变化可能在耳鸣的发病机制中发挥重要的作用。
【图文】：

示意图,内毛细胞,序列,示意图

荧光重合后双标记后的色对呈现一种橙黄色的显示。当荧光色对第一次出现时，序列扫描就正式开始进行，直到扫描到荧光色对不再出现时时，扫描到此结束。这时，我们收集在此过程中二维合成的图像，以序号顺序排列。具体方法如图1图1 内毛细胞序列扫描示意图注：图中A为内毛细胞形态，其中横截面为序列扫描的各个层面；B为一个序列扫描层面（X-Y），其中球体表示带状突触；C为三维显示多个序列扫描层面。2.3.6 三维建模打开计算机 3D max 软件，选中菜单项目，将上一步扫描得到的序列调入视面窗口，按照从上到下的顺序，，逐一导入扫描序列。例：首先将第一幅二维合成图像先导入，出现橙色荧光的位置我们用球体做一个标记。荧光的形状越大，标记的球体也相应越大，上下两幅图像中，橙色荧光如果出现的位置相同，则为同一个突触；则代表新突触。依此类方法逐一进行， 3D max 软件可以自动算出在每个图像中的突触总数量（见图 2

示意图,软件,示意图,橙色

3Dmax8.0软件全部窗口示意图
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R764.45;R-332

【相似文献】