Smurf1增强PDK1 Neddylation修饰机制及功能

发布时间：2020-03-31 20:35

【摘要】：目的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB/Akt)信号通路在细胞进程中发挥至关重要的调控作用。Akt是该信号通路调控的关键成员。3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1(PDK1)位于Akt的上游,可以在Thr308位点将其磷酸化以激活其激酶活性。然而,除磷酸化之外,PDK1的翻译后修饰很少报道。在此我们探索了PDK1(3-磷酸肌醇依赖蛋白激酶1)Neddylation修饰机制及对Akt磷酸化激酶活性的影响。方法免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白质印迹(WB)分析PDK1的Neddylation修饰机制,类泛素化修饰实验筛选出Smurf1促进PDK1 Neddylation修饰,定点突变和免疫共沉淀和免疫印迹确定PDK1和Smurf1之间的相互作用区域。PDK1/Akt信号通路可通过EGF(表皮生长因子)或FBS(胎牛血清)刺激而起作用。在正常的MEF细胞中,表皮生长因子刺激诱导Akt的磷酸化在第5min时上调,持续1小时而没有显着下降。为此我们选择Smurf1敲除MEF细胞及Smurf1野生型MEF细胞,EGF刺激后观察两者之间的变化。结果我们发现了PDK1是NEDD8的新底物。我们验证了Smad泛素调节因子-1(Smurf1),一种HECT型E3,是PDK1的NEDD8-E3。Smurf1 WW结构域与PDK1相互作用并对其激酶结构域进行neddylate,这可以增加PKD1的催化能力。敲低Smurf1或用MLN4924阻断neddylation途径会减弱Akt的磷酸化并弱化其细胞外信号传导功能。结论Smurf1促进PDK1 Neddylation修饰并增强其激活Akt磷酸化的激酶活性,我们的研究提供了一个新的PDK1调节机制,并揭示PI3K/Akt途径和neddylation途径之间的新串联。
【图文】：

图 6 PDK 参与部分癌症发生发展除了表达数据之外，，PDK1 参与肿瘤发生的研究证据主要来自细胞模型中PDK1 的实验性增加。在乳腺癌细胞中，PDK1 过表达能够有效地诱导细胞悬浮生长[21-23]。此外，PDK1 在细胞中的过度表达导致肿瘤过度生长，例如在免疫受损小鼠中异种移植的人乳腺癌细胞中[23]。同样，肿瘤细胞的运动能力和侵袭能力可以通过人工增加 PDK1 的表达水平来维持[15, 22]。4、PDK1 在肿瘤微环境中的作用越来越多的数据支持这样的假设：肿瘤微环境（TME），特别是其细胞成分，如巨噬细胞，淋巴细胞，成纤维细胞和血管内皮细胞，直接调节肿瘤细胞的生长和侵袭性[24, 25]。虽然 PDK1 在 TME 中的作用尚未经过特定的研究，但它确实在这些细胞类型中有很多特征

IB: HAIB: FlagIB: FlagP:ILsatey共转 239T 细胞检测 PDK1 的f1 与 PDK1 有相互作用化修饰，然泛素连接酶 E3 是 PDK1 发生相互作用，故我EK293T 细 胞 内 分 别1,Myc-c-IAP2[21],Myc-MDM作用（图 2）。-PDK1Vector+ + ++-+ +NF168R c-IAP1 -cIAP2 DM2M Smurf1
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R363

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本文编号：2609545