超声引导下裸鼠肝癌移植瘤模型射频消融环状RNA表达谱的研究

发布时间：2020-04-02 12:23

【摘要】：研究背景及目的:肝癌是全球癌症相关死亡的第二大原因,是世界上最常见和恶性程度最高的肿瘤之一。全球每年有近85万新发肝癌病例,我国新发例数和死亡例数量约占全球的50%以上。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)作为原发性肝癌最主要的一种亚型,约占原发性肝癌的90%,在全世界范围内的发病率呈逐年上升的趋势。射频消融(Radiofrequency ablation,RFA)是目前针对肝癌应用最广泛的热消融治疗技术,也是肝癌微创治疗的代表性介入治疗方式。随着射频消融仪器设备的改进及影像诊疗技术的不断提高,射频消融在HCC患者临床治疗中的地位日益显著。环状RNA(CircularRNAs,CircRNAs)是一种特殊类型的内源性非编码RNA,是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴,并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子,已被证实参与多种疾病的发生发展过程。然而,circRNA在肝癌射频消融中的表达谱仍然未知。本研究旨在从circRNA为切入点,利用基因芯片技术从射频消融的裸鼠肝癌移植瘤模型中筛选出差异性表达的circRNA,探讨circRNA在射频消融HepG2裸鼠肝癌移植瘤模型中可能的作用。材料和方法:1.裸鼠肝癌模型的建立对8只雄性免疫缺陷鼠(Balb/c裸鼠)(20±2g)脊柱侧注射HepG2细胞100μl(2x10~6个/ml)进行Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型建模。应用二维超声(Ultrasonic,US)、彩色多普勒(Color Doppler flow imaging,CDFI)检查技术对HepG2裸鼠皮下移植瘤模型造模情况进行评估。2.超声引导下裸鼠射频消融随机平均分配实验组(N=4)和对照组(N=4),对实验组4只Balb/c裸鼠进行仰卧位超声引导下Cool-tip冷循环系统RFA不全消融(射频功率30W,持续消融10s)。RFA后处死实验组及对照组裸鼠,立即(10min)取新鲜肿瘤组织并等分为2份(100mg),一份进行病理学检查,观察肿瘤细胞;另一份肿瘤新鲜组织以磷酸缓冲盐溶液清洗干净,样本立即横置放入装有5倍体积RNAlater保护液的冻存管中,随即放入-80°C液氮中冷冻并送组织芯片测序。3.CircRNA芯片分析提取8例样本的总RNA并对纯度和浓度进行定量。通过变性琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。对检验合格的样品使用Agilent Scanner G2505C进行扫描,进行Arraystar Human CircRNA Array v2检测分析。使用R软件limma软件包进行原始数据分位数归一化和后续的circRNA差异表达数据处理。4.CircRNA实时荧光定量PCR(q PCR)验证选取差异上、下调的circ RNA分别施行实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测,对本研究内部芯片的可靠性进行验证。5.CircRNA在HCC中的临床表达通过大数据挖掘技术,检索Gene Expression Omnibus(GEO)数据库,回顾性分析基因芯片中circRNA在HCC中临床组织样本表达的病例对照研究。采用独立样本t检验比较分析差异表达circRNA在HCC和相邻癌旁组织的表达水平以及应用Stata12.0进行系统评价及异质性分析,计算标准化均数差(Standardised mean differnece,SMD)、总受试者工作曲线(Summary receiver operator characteristic curve,SROC)及95%CI对GEO数据库芯片合并统计量,对circRNA在HCC中的表达水平及诊断价值进行评估。绘制漏斗图及Egger回归方程评估有无发表偏倚。结果:1.裸鼠肝癌模型的建立对HepG2裸鼠皮下移植瘤模型造模情况进行评估。二维超声(US)提示:于裸鼠背侧脊柱旁皮下探及一低回声团,病灶的大小约1.4x0.1cm、边界尚清、形态不规则、内回声不均。CDFI彩色多普勒显像提示病灶内有较丰富血流信号。2.超声引导下裸鼠射频消融解剖未经射频消融对照组四只肝癌裸鼠,将肿瘤组织切开后,可见肿瘤组织由多个白色的结节样团块组成。瘤体不与皮肤及皮下组织粘连,无明显浸润生长,易于剥离。HE染色病理切片镜下示肿瘤细胞成索状或片状排列,细胞大小不一,可见多核瘤细胞,细胞核大深染,核分裂像增多,部分细胞胞质丰富而红染,细胞核呈圆形或卵圆形。射频消融不全治疗实验组裸鼠肝癌肿瘤组织不全毁损,将肿瘤组织切开后,肉眼可见瘤体表面呈白色烧灼样。光镜下见肿瘤细胞排列成小梁状。肿瘤细胞体积大,呈多角形、圆形和柱状,肿瘤细胞核浆比升高,细胞核深染,可见病理性核分裂象,可见片状坏死。3.CircRNA芯片分析8例雄性Balb/c裸鼠的送检瘤体组织标本均符合CircRNA芯片质量检测的要求。对circRNA芯片检测的原始数据归一化和低表达信息进行过滤后。通过RNA-seq技术,散点图和火山图分析显示共筛选到在未消融完全实验组和未消融对照组76个显著差异表达的circRNA(21个差异性上调circRNA和55个差异性下调circRNA)(|FC|1.5,P0.05)。4.CircRNA实时荧光定量PCR(q PCR)验证对挑选的上调circRNA hsa_circRNA_103595和下调circRNA hsa_circRNA_001264分别行qPCR检测,在实验组样本中hsa_circRNA_103595上调1.926倍(P=0.037),hsa_circRNA_103595下调1.554倍(P=0.531)。与circRNA芯片的结果hsa_circRNA_103595上调1.528倍(P=0.001),hsa_circRNA_103595下调1.591倍(P=0.005)基本一致。5.CircRNA在HCC中的临床表达基于GEO数据库组织芯片,对21个差异性上调circRNA和55个差异性下调circRNA分别做HCC临床组织样本表达验证。GSE78520,GSE94508,GSE97332 3个芯片纳入本次研究。在GSE94508芯片中,过表达的circRNA分别为hsa_circRNA_001264,hsa_circRNA_101225,hsa_circRNA_100139;低表达的circRNA分别为hsa_circRNA_100168和hsa_circ RNA_103392。在GSE97332芯片中,高表达的circRNA分别为hsa_circRNA_103666,hsa_circRNA_103595,hsa_circRNA_100139,hsa_circRNA_100505;低表达的circ RNA分别为hsa_circRNA_100168,hsa_circRNA_001264,hsa_circRNA_104733,hsa_circRNA_101225,hsa_circRNA_100308,hsa_circRNA_400101和hsa_circRNA_100065。通过对在三个芯片中均有表达数据的circRNA行合并效应量,得到标准化均数差(Standarised mean difference,SMD)的结果显示,hsa_circRNA_100168在HCC中呈低表达(-2.089,95%CI:-2.089-(-3.447),P=0.003),其他circRNA的SMD均无统计学意义(P0.05)。结论:1.裸鼠肝癌模型的建立运用HepG2瘤细胞活体种植法制作的裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,该方法周期较短,成功率达100%。其生长行为与人类肝癌相似,适于施行肿瘤的实验性研究。2.超声引导下裸鼠射频消融与对照组相比,不全消融实验组裸鼠肝癌皮下移植瘤瘤体镜下见残留肿瘤细胞,术区片状坏死,提示消融不完全。可行后续的超声引导下裸鼠射频消融circRNA表达谱研究。3.CircRNA测序分析本实验的不全消融裸鼠肝癌皮下移植瘤样本中,circRNA表达发生了差异性变化。4.CircRNA实时荧光定量PCR(q PCR)验证PCR结果提示本研究内部芯片的circRNA表达数据可靠。5.CircRNA在HCC中的临床表达本研究内部芯片的差异表达circRNA可能参与HCC的发生发展并发挥作用。在射频消融HepG2裸鼠肝癌移植瘤样本中,本研究证实了在射频消融HepG2裸鼠肝癌移植瘤模型中circ RNA表达的改变,这可能在RFA后HCC患者的生理和病理过程中发挥重要作用。这些发现不仅为研究RFA HCC的分子机制提供了新的方向,而且也为通过调控circRNA治疗HCC提供了新的可能性。
【图文】：

肿瘤细胞,肿瘤组织,热能,局部治疗

ure 2. RFA uses thermal energy to destroy tumor tissue and causes irreversible damage to tumor cing tumor cells.. RFA 利用热能损毁肿瘤组织，引起肿瘤细胞的不可逆损伤，，从而杀灭肿瘤细胞。RFA 的临床优势包括了低死亡率、局部治疗、患者耐受重复治疗等。研究也显示 RFA 是种安全有效的早期 HCC 线治疗方案，接受 RFA者其 5 年生存率可达 67.9％[7]。Cool-tip 射频消融系统可以用于原发

模式图,成环,环状,环化

17Figure 3. Four possible looping patterns of circRNA.A. Lariat-driven circularization; B. Intron-pairing-driven circularization. C. Circular intronic RNA. D. RBPor trans-factor driven circularization. (Derived from “Qu S, Yang X, Li X, et al. Circular RNA: A new star ofnoncoding RNAs.[J] Cancer letters, 2015 Sep 1;365(2):141-8.”)图 3.环状 RNA 可能的 4 种成环模式。A. 套索驱动的环化; B. 内含子配对驱动的环化；C. 来源于内含子； D. RNA 结合蛋白（RBP）或反式因素驱动的环化（源自“Qu S, Yang X, Li X, et al. Circular RNA: A new star of noncoding RNAs.[J] Cancer letters, 2015 Sep1;365(2):141-8.”）
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7;R445.1;R-332

【参考文献】