自噬参与清除Bcl-2抑制剂诱导的内质网膜重构的机制研究

发布时间：2017-03-22 15:07

  本文关键词：自噬参与清除Bcl-2抑制剂诱导的内质网膜重构的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 本研究中，我们通过利用Bcl-2抑制剂诱导内质网膜重构，观察内质网膜重构的清除方式，探讨内质网膜重构与自噬泡生成的联系。 方法 利用免疫荧光检测方法，观测内质网膜蛋白的Bap31、Calnexin在细胞中的分布情况，代表内质网膜的状态，观察药物诱导Hela细胞发生内质网膜重构。并利用ShRNA敲除技术沉默Hela细胞Bcl-2和Mcl-1基因，确认Bcl-2家族蛋白与内质网膜重构的关系。利用内质网应激抑制剂TUDCA，在不同时间点检测内质网应激相关蛋白的表达，探讨药物诱导的内质网膜重构与内质网应激之间的关系。我们检测了联合给与Bcl-2抑制剂S1和ABT-737后内质网膜蛋白的表达量，同时加入自噬抑制剂3-MA来进一步确认，观测内质网膜被降解。通过高分辨率成像系统观测免疫荧光蛋白标记的自噬标志蛋白Beclin-1，Atg-12，LC-3与内质网膜蛋白Calinexin，Bap31的分布，代表内质网与自噬泡的位置，探讨内质网膜重构与自噬的关系。并利用加入自噬诱导剂雷帕霉素，自噬抑制剂CQ后观察内质网膜重构现象。 结果 Hela细胞在两种Bcl-2抑制剂S1与ABT-737联合给予4小时，增加了内质网膜重构现象的发生。在联合给予抑制剂后，发现细胞中内质网膜蛋白（Bap31/Calnexin）聚集。利用ShRNA敲除Hela细胞Bcl-2与Mcl-1基因后也发现了内质网膜重构现象。另外，在Hela细胞联合给予S1和ABT-737后内质网膜蛋白Calnexin发生重构并且随着给药时间的延长重构加重。而在撤除S1和ABT-737后内质网膜重构现象快速地缓解并最终消失。 检测Hela细胞联合给予Bcl-2抑制剂S1和ABT-737后，，内质网应激相关蛋白Bip、eIF2a的蛋白表达，结果显示表达上调，但是eIF2a的磷酸化水平并没有明显的变化，CHOP的蛋白表达下调。 在研究中我们发现Hela细胞给与Bcl-2抑制剂S1和ABT-7374小时显著下调内质网膜蛋白Calnexin和Bap31。当加入自噬抑制剂3-MA，联合给予S1和ABT-737后4小时，在3-MA作用下内质网膜蛋白显著回升，提示自噬有可能参加内质网膜的清除。 我们的后续研究结果显示，Hela细胞在联合给予Bcl-2抑制剂S1和ABT-737后自噬相关蛋白Atg12-Atg5复合体的表达量增加。与对照组比较，S1联合ABT-737诱导Hela细胞自噬相关蛋白LC3-II表达量上升。S1联合ABT-737诱导Hela细胞自噬相关蛋白Beclin-1的表达量上升。此外，S1联合ABT-737给予后可以在Hela细胞中看到LC-3点状聚集。 通过高分辨率成像系统分析，发现内质网膜标志蛋白Calnexin,Bap31聚集，细胞自噬相关蛋白与内质网膜蛋白有共定位。自噬激活剂雷帕霉素能够恢复S1联合ABT-737诱导的内质网膜重构。然而相反的，自噬抑制剂CQ对于S1联合ABT-737诱导的内质网膜重构无明显改变作用。 结论 联合给与Hela细胞Bcl-2抑制剂S1与ABT-737可以诱导细胞发生内质网膜重构。内质网膜重构与内质网应激在时间点上是分离的。在Hela细胞给与S1和ABT-737后诱导细胞发生自噬，并且自噬会清除部分重构的内质网膜。
【关键词】：内质网 Bcl-2家族蛋白 内质网膜重构 自噬
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 主要英文缩写词表11-12
• 引言12-14
• 第1章 文献综述14-24
• 1.1 内质网形态改变14-19
• 1.1.1 内质网结构、功能及内质网动态14-15
• 1.1.2 几种已发现的内质网形态学改变15-19
• 1.1.3 内质网应激与内质网形态学改变19
• 1.2 Bcl-2 家族蛋白及内质网形态学改变19-22
• 1.2.1 Bcl-2 家族蛋白19-20
• 1.2.2 Bcl-2 家族蛋白与内质网形态学改变的关系20-21
• 1.2.3 Bcl-2 抑制剂21-22
• 1.3 自噬与内质网形态改变22-24
• 1.3.1 自噬22-23
• 1.3.2 自噬与内质网形态学改变的关系23-24
• 第2章 材料和方法24-30
• 2.1 实验材料24-26
• 2.1.1 主要试剂24-25
• 2.1.2 实验仪器25-26
• 2.2 实验方法26-30
• 2.2.1 细胞系培养26
• 2.2.2 细胞传代26
• 2.2.3 细胞冻存26
• 2.2.4 细胞中总蛋白提取26-27
• 2.2.5 Bio-Rad 法测蛋白浓度27
• 2.2.6 Western blot27
• 2.2.7 Mcl-1、Bcl-2 shRNA 转染实验操作27-28
• 2.2.8 免疫荧光检测28-29
• 2.2.9 统计学处理29-30
• 第3章 实验结果30-41
• 3.1 S1 联合 ABT-737 诱导 Hela 细胞发生内质网膜重构30-33
• 3.2 S1 联合 ABT-737 诱导 Hela 细胞发生内质网膜重构在 UPR相关变化之前33-34
• 3.3 S1 联合 ABT-737 下调 Hela 细胞内质网膜蛋白34-36
• 3.4 S1 联合 ABT-737 诱导 Hela 细胞发生自噬36-38
• 3.5 内质网膜重构部分被自噬清除38-41
• 第4章 讨论41-44
• 第5章 结论44-45
• 参考文献45-59
• 致谢59

  本文关键词：自噬参与清除Bcl-2抑制剂诱导的内质网膜重构的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：261730