人尿源性干细胞的永生化及其诱导分化研究

发布时间：2020-04-13 18:29

【摘要】：目的：运用piggyBac system筛选在干细胞中能启动基因表达的高效启动子，选择合适的启动子应用于猿肾病毒40大T抗原（SV40Tag）基因的表达，建立永生化的人尿源性干细胞（urine derived stem cell，USC）。通过对永生化尿源性干细胞的生物学鉴定，明确其干细胞分化潜能，并通过骨形成蛋白（BMP9）诱导分化，进一步明确永生化尿源性干细胞具有多向分化潜能，为组织工程学及再生医学提供新型的稳定的细胞来源。方法：运用piggyBac转座酶系统构建并比较带有不同启动子的质粒，用红色荧光蛋白（RFP）和萤火虫荧光素酶（firefly luciferase Fluc）作为报告基因，通过脂质体转染的方法建立稳定表达的细胞系。通过RFP表达强度，Fluc定量检测及流式细胞技术，筛选在干细胞中稳定高效表达的启动子。利用该启动子构建带SV40Tag基因表达的质粒，将SV40Tag基因质粒及转座酶质粒（transposase）共转染至临床分离的人尿源性干细胞中。潮霉素（Hygromycin）筛选后阳性细胞克隆并连续传代，观察细胞形态学以及增殖情况，RT-PCR，免疫荧光等检测转染细胞的生物学特性，细胞裸鼠皮下注射检测其安全性。运用BMP9诱导成骨分化，通过体外细胞碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色（Alizarin-S staining）、油红O（Oil-red staining）染色、微团细胞培养（Micro Mass）等特异性染色检测其成骨、成软骨及成脂分化。体内实验进一步利用Micro-CT，病理切片染色等检测尿源性干细胞在BMP9诱导下具有多向分化功能。结果：通过RFP荧光显示，Fluc及流式细胞定量检测，hEFH启动子在干细胞系中表达外源基因能力明显强于其他启动子，运用hEFH启动SV40Tag基因在尿源性干细胞中表达，筛选获得的阳性克隆扩大培养，即永生化尿源性干细胞（immorterlized urine derived stem cell，iUSC），增殖能力强，能连续传代培养。RT-PCR证实iUSC表达SV40Tag基因，而用翻转重组酶（Flippers recombination enzyme Flp）处理iUSC可敲除RFT-SV40Tag基因而逆转永生化。应用免疫荧光细胞化学技术检测该细胞株表达干细胞表面标志物CD73、CD44、CD90(Thy-1)、CD29(Integrin)、CD105(Endoglin)、CD166（ALCAM）、BMPR II、SSEA4、CD117、CD133。应用BMP9诱导iUSC分化，细胞碱性磷酸酶染色、茜素红染色、油红O染色等显示该细胞向成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞分化，转染细胞裸鼠皮下及肌肉接种，4周后无肿瘤形成，通过Micro-CT及病理切片染色等显示该细胞在BMP9诱导下，在体内具有良好的成骨成软骨及部分成脂多向分化潜能。结论：运用piggyBac system成功筛选出适合于干细胞基因表达的启动子hEFH，并用该启动子通过脂质体转染技术成功构建SV40Tag永生化尿源性干细胞，生物学鉴定该细胞具有间充质干细胞特性，利用BMP9诱导分化，在体内体外实验都证实该细胞具有成骨、成脂、成软骨分化功能，进一步证实了永生化人尿源性干细胞的多分化潜能，可以进一步诱导分化用于泌尿生殖系统的损伤修复，并为组织工程学及再生医学的体外研究和发展应用提供了安全稳定的细胞来源。
【图文】：

示意图,转座酶,质粒,启动子

重庆医科大学博士研究生学位论文2 结果2.1 构建带有 RFP 及 Fluc 报告基因的不同启动子质粒运用 piggyBac 转座酶系统 pMPB 质粒作为基础质粒，，该基础质粒带有 PB-TR，piggyBac 转末端重复序列，核心绝缘子， BSD 筛选择标记序列，SV40 多聚 A 信号等序列。在 pMPB 基础质粒上克隆进 RFP 报告基因及 Fluc 报告基因，并以 6 种常用的启动子分别启动表达相应报告基因。（如图 1）

启动子,稳定表达,拷贝数,荧光显微镜

图 2 表达不同启动子的 HEK293 及 iMEF 细胞中 mRFP 的表达情况gure 2. Verification of the piggyBac vector-mediated stable integrations in HEK-293 cellsEFs. Stable HEK-293 (a) and iMEF (b) lines were established using the six promoter vecd pMPB empty vector (EV) as described in Methods. Genomic DNA was isolated from tines, and subjected to touchdown PCR analysis using the primer pair specific for mRFPFLuc (not shown). GAPDH was used to normalize the genomic DNA level used in the PCanalysis.4 HEK293 细胞中 CMV 启动子启动效果最强，而在 iMEF 细胞中hEFH 启动子启动效果最强前期实验已经证明 RFP 的拷贝数在 6 种启动子的 HEK293 细胞是相同的， 3（A）所示，在荧光显微镜下观察经过筛选的稳定表达 RFP 的含不同启动子
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329

【参考文献】